化学氧化强化生物堆修复石油污染土壤研究

所属分类：农业论文阅读次时间：2021-12-16 10:41

本文摘要：摘要：生物修复技术是一种成本较低且环境友好的可持续发展修复技术，但是其所需的修复时间较长。采用化学氧化强化生物堆修复石油污染土壤的方法探究其修复效果并采用BIOLOG ECO板和高通量测序技术探明微生物群落的响应机制。结果表明，通过240 d的生物堆修复，生物修

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　　摘　要：生物修复技术是一种成本较低且环境友好的可持续发展修复技术，但是其所需的修复时间较长。采用化学氧化强化生物堆修复石油污染土壤的方法探究其修复效果并采用BIOLOG ECO板和高通量测序技术探明微生物群落的响应机制。结果表明，通过240 d的生物堆修复，生物修复(NP)和氧化剂强化生物修复(NP_O)处理使土壤中总石油烃从30649mg·g–1分别下降至5889mg·g–1和2351mg·g–1，化学氧化强化生物修复后的土壤石油烃浓度低于国家风险管制值(GB 36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量测序结果进一步表明，氧化剂处理的土壤中微生物活性迅速恢复，且化学氧化强化生物修复处理中具有石油烃降解潜力的菌属Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是该处理的主要细菌标记物。

　　关键词：石油污染土壤;化学氧化;生物修复;16s rDNA;细菌群落

石油土壤污染

　　石油作为重要的能源化工原料，在其开采、运输、加工和使用过程中进入土壤环境，造成严重的土壤污染[1]。石油进入土壤后，会破坏土壤结构，降低氮磷等有效土壤养分。石油烃作为石油中的主要污染物，主要包括烷烃和芳香烃。这些污染物可通过挥发或食物链富集等途径进入生物体内，对生态环境和人类健康构成严重威胁，因此，石油污染土壤亟待修复。常用的石油污染土壤修复方法主要包括物理、化学和生物修复。其中生物修复是一种修复成本较低且环境友好的可持续修复技术[2]。该技术利用微生物代谢，达到降解污染物的目标[3]。

　　但生物修复后期难降解污染物，如高环芳烃、长链烷烃等及有毒含氧中间产物会抑制微生物活性，影响微生物代谢，从而降低修复效率[3-4]。化学氧化修复是利用化学氧化剂(如芬顿试剂、高锰酸钾、过硫酸钠等)快速降解污染物的技术方法[5]。化学氧化剂在对总石油烃(total petroleum hydrocarbons，TPHs)等有机污染物氧化过程中，能够将长链烷烃降解成短链烷烃，并且不受土壤生物毒性影响，从而去除污染物。完全采用化学氧化修复成本高，且会对土壤造成二次污染。但是采用适量的化学氧化剂强化生物修复能克服上述单一修复技术的局限，有效提高修复效率[6-8]。

　　过硫酸钠具有溶解度大、稳定性好、pH适应范围广以及修复后土壤微生物活性可恢复等优点，成为强化生物修复的主要化学氧化剂[9]。如罗俊鹏等[10]研究表明氧化剂强化生物修复能够有效提高土壤中有机污染物的去除效率。本研究采用生物堆对江苏油田某石油污染进行修复，修复后期采用过硫酸钠对石油污染土壤进行氧化，研究其进一步强化生物修复的效果。并探究不同处理对TPHs的去除效果与微生物活性和群落结构变化的关系，为化学氧化强化生物修复石油污染土壤提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1 仪器和试剂

　　仪器：GC-FID(Agilent 7890B，美国)，旋转蒸发仪，酶标仪等。试剂：过硫酸钠(Na2S2O8)为分析纯;正己烷(nHexane，C6H14)、二氯甲烷(dichloromethane，CH2Cl2)均为色谱纯;无水硫酸钠(分析纯，400℃活化6 h)、弗罗里硅土(60～100目，层析用;400℃活化6 h)。

　　1.2 供试土壤

　　石油污染土壤取自江苏油田，TPHs含量为30649mg·kg–1，pH为8.01。

　　1.3 实验设计

　　生物修复采用生物堆。生物堆反应器为160 L。堆肥处理中按油泥质量的12%添加猪粪，3%添加稻草秸秆。具体操作为在油泥中添加猪粪和稻草秸秆后充分搅拌均匀，堆肥桶外裹上保温膜，底部接渗漏液出口管，加水调节堆体初始含水率为50%左右，定期翻堆通风与添加水分。将温度计插入堆体中，每天记录下温度。为避免油泥中污染物分布不均匀，采取多点取样混合法进行采样，分别于堆肥的第0、40、80、120、160和240 d采样。每次取样50 g，将采集到的样品冻干，研磨后过60目筛，使用GC-FID测TPHs含量，于第240 d检测土壤中土壤微生物活性、群落结构与多样性。处理如下：

　　(1)对照(Control)：70 kg油泥;(2)生物修复(NP，添加氮磷的生物修复处理)：70 kg油泥+8.4 kg猪粪+2.1 kg稻草;(3)氧化剂强化生物修复(NP_O，在NP基础上氧化剂强化)：70 kg油泥+8.4 kg猪粪+2.1 kg稻草+氧化试剂。氧化剂于堆肥的第160 d加入50 mmol/kg 过硫酸钠和 10 mmol/kg 硫酸亚铁，充分搅拌均匀后取样测TPHs浓度。

　　1.4 TPHs的提取及检测

　　称取冻干土样(60目)2 g，以二氯甲烷作为萃取剂，采用索氏提取法于54℃水浴提取石油烃16～18 h。将提取液旋蒸浓缩后通过含有4 g弗罗里硅土和1 g无水硫酸钠的玻璃砂芯层析柱净化，用色谱纯正己烷洗脱净化的石油烃，将净化的的洗脱液浓缩至2 mL后用GC-FID进行检测，气相色谱条件采用中华人民共和国国家环境保护标准《土壤和层积物石油烃(C10~C40)的测定气相色谱法》(HJ 1021—2019)。

　　1.5 碳素利用法(Biolog法)分析微生物活性

　　本研究采用Biolog ECO板对各处理土壤的微生物群落代谢活性进行测定。称取相当于5 g干土的新鲜土样，于装有50 mL 0.85%NaCl无菌溶液中，在30℃震荡培养箱中以150 r·min–1的速度振荡30 min，静置15 min后，取上清液稀释100倍。Biolog ECO板的每个孔中分别加入稀释液150 μL，30℃培养箱中培养7 d，期间每24 h于酶标仪中采用590 nm测定吸光度。采用31个孔的吸光度平均值(average well color devel-opment，AWCD)来表征微生物的平均活性。

　　1.6 高通量测序

　　称取新鲜土壤样品0.5 g，采用土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA® Spin Kit for Soil，MP Biomedicals，USA)，按照试剂盒中提供的说明书提取土壤DNA。将土壤DNA样品送至中国上海美吉生物医药科技有限公司，由其采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增及产物纯化，采用质量均一化后的PCR产物构建文库并在Illumina-Miseq平台上进行测序。测得的序列降噪后按照97%相似度进行运算分类单位(operationaltaxonomic units，OTU)划分，采用SILVA数据库对OTU的分类信息进行比对。

　　按照本研究样本中最少序列数27876抽凭，然后采用抽凭后的数据计算微生物群落多样性指数，包括Shannon、Chao、Invsimpson和ACE。采用主成分分析(principal componentanalysis，PCA)研究各处理间及各处理内细菌群落组成的相似性和差异性。采用LEfSe软件进行线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)研究各处理中具有显著富集的菌属。

　　1.7 数据处理

　　采用R对数据进行方差分析及作图，各个处理之间的差异采用邓肯式多重方式比较(p<0.05)。

　　2结　果

　　2.1 土壤修复过程中TPHs的变化

　　生物堆修复能够显著降低土壤中TPHs含量。经过240 d的修复， NP和NP_O处理土壤中TPHs含量由30649mg·kg–1分别下降至5889mg·kg–1和2351mg·kg–1。全部达到工业用地标准4500mg·kg–1，并且在NP_O处理中，化学氧化能够进一步强化土壤中TPHs的去除。

　　2.2 土壤修复过程中微生物活性与数量的变化

　　相较于对照组(Control)，生物修复处理组(NP、NP_O)显著增强了微生物群落的代谢活性。并且，相较于NP处理组，氧化剂处理80 d(修复的第240 d)后， NP_O组中微生物代谢活性几乎未受到氧化剂的影响。

　　2.3 土壤修复过程中细菌群落结构与多样性的变化

　　2.3.1细菌群落多样性变化

　　主坐标分析(principal coordinate analysis，PCoA)。各处理内细菌群落结构相似，各处理间细菌群落结构显著分异。化学氧化处理(NP_O)和未氧化处理组(Control和NP)分别位于PCoA1轴的负向和正向两端;而生物堆处理组(NP、NP_O)和对照(Control)被PCoA2轴分开，分别位于正向端和负向端。各处理中土壤细菌多样性指数。Alpha多样性指数结果显示，相较于对照处理(Control)，生物修复处理(NP、NP_O)显著降低了土壤中细菌的多样性，且采用化学氧化强化生物修复处理(NP_O)进一步降低了土壤中细菌多样性。

　　2.3.2细菌群落分类

　　细菌群落门和属水平上相对丰度结果。化学氧化强化生物修复处理显著降低了细菌群落在门水平上的多样性。在修复各处理中，变形菌门的相对丰度最高，对照组(Control)、NP和NP_O中依次为68.35%、67.22%和76.35%，其中Gammaproteobacteria最为优势，并且其相对丰度在生物修复的处理中显著增加。化学氧化强化生物修复提高了Bacteroidetes的相对丰度。

　　在属水平上，采用热图和LEfSe分别分析了优势属和各处理中的标记属。LEFse图中由中心到外部的圆圈依次表示门、纲、目、科和属的级别，圆点的大小代表微生物的相对丰度。红色(Control)、青色(NP)、蓝色(NP_O)圆点表示在其对应颜色的组别中的微生物标记物。结果表明，NP_O处理的主要相对丰度较高且细菌标记物是Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Porticoccaceae_C1.B045等。其中NP_O处理的Microbacterium(2.47%)、Paracoccus(2.98%)、Pseudomonas(3.51%)、Stenotrophomonas(11.98%)和Porticoccaceae_C1.B045 (2.64%)的相对丰度均高于其它处理组。

　　3讨　论

　　微生物修复石油污染土壤费用较低且对环境友好，有利于可持续发展。然而，在生物修复的后期，石油污染物中的长链烷烃由于不易被微生物降解而残留与土壤中，污染物降解过程中产生的有毒的中间产物会抑制微生物活性，导致生物修复后期降解效率下降，修复周期延长。研究表明，化学氧化能够有效破坏长链烷烃并快速降解有机污染物及其中间产物，通过采用合适的氧化剂能够使土壤微生物快速恢复活性，土壤TPHs含量显著降低[11]。

　　本研究采用化学氧化强化石油污染土壤生物堆修复，分析修复过程的微生物群落结构变化以探究其修复效果与修复机制的研究结果表明，生物堆(NP、NP_O)修复240 d后，土壤中TPHs分别分为5889mg·kg–1和2351mg·kg–1，其中化学氧化强化生物修复后的土壤石油烃含量低于《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 36600—2018)中的设定标准(4500mg·kg–1)。

　　为进一步揭示化学氧化强化生物修复相关机制，本研究发现，与NP相比， NP_O处理80 d后，土壤TPHs去除量进一步提高，但微生物代谢活性未呈现显著差异。说明添加适量的氧化剂，土壤修复过程中微生物活性能够得到快速恢复，并使石油烃得以快速去除。

　　这与Zhang等[12]报道的结果相一致。为了进一步探究细菌群落与石油烃降解的关系，本研究利用高通量测序对细菌群落结构和多样性进行分析。PCA表明，影响群落结构变化的主控因素是化学氧化，产生的自由基具有强氧化性，甚至会造成细胞结构损坏导致微生物活性失效[13]，从而使微生物群落结构的丰富度减少，导致微生物群落的多样性降低。门水平的微生物群落结构分析显示，NP_O处理中放线菌门的相对丰度增降低，Bacteroidetes的相对丰度增加。

　　在门水平上，与对照相比，生物堆处理组(NP、NP_O)中Gammaproteobacteria相对丰度显著增加，且该处理组石油烃去除率最高。已有研究表明，Gammaproteobacteria是石油污染土壤中降解石油烃的主要功能菌类群[14]。尽管生物堆修复处理组(NP、NP_O)降低了微生物群落的多样性，但与污染物去除的优势降解微生物群落多样性无关，主要与土壤中相关功能菌的增殖有关，这与课题组前期的研究结果一致，即石油烃的去除与某种类型功能菌的富集有关[15]。

　　LDA分析结果发现，属水平上，Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是NP_O处理的主要细菌标记物;有研究表明Arthrobacter和Paenarthrobacter属具有石油降解能力，如Bai等[16]研究证明Pseudomonas和Stenotrophomonas能有效降解烃类污染物。许殷瑞等[17]研究发现，throbacter是石油污染土壤中的主要嗜油属。另外Hou等[15]的研究数据也证明，些菌属是修复石油烃污染物的主要细菌类群。说明石油烃的降解与这2菌的富集有关。

　　4结　论

　　NP和NP_O处理使土壤中TPHs从30649mg·g–1分别下降至4389mg·g–1和1351mg·g–1，修复后的土壤石油烃浓度低于国家风险管制值(GB36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量测序结果进一步表明，氧化剂处理的土壤中微生物活性迅速恢复，且预氧化联合生物刺激修复处理中Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045作为主要细菌标记物，多数具有降解石油烃的能力。该结果显示了化学氧化强化微生物修复的可行性，为未来石油烃污染土壤修复的实践应用提供了理论依据。

　　参考文献：

　　HOANGSA，LAMBD，SESHADRIB，etal.Rhizoremediationasagreentechnologyfortheremediationofpetroleumhydrocarbon-contaminatedsoils[J].JournalofHazardousMaterials，2021，401:123282.

　　[1]FODELIANAKISS，ANTONIOUE，MAPELLIF，etal.Allochthonousbioaugmentationinexsitutreatmentofcrudeoil-pollutedsedimentsinthepresenceofaneffectivedegradingindigenousmicrobiome[J].JournalofHazardousMaterials，2015，287:78-86.

　　[2]OSSAIIC，AHMEDA，HASSANA，etal.Remediationofsoilandwatercontaminatedwithpetroleumhydrocarbon：Areview[J].EnvironmentalTechnology&Innovation，2020，17:100526.

　　[3]ZHENL，HUT，LVR，etal.Successionofmicrobialcommunitiesandsynergeticeffectsduringbioremediationofpetroleumhydrocarbon-contaminatedsoilenhancedbychemicaloxidation[J].JournalofHazardousMaterials，2021，410:124869.

　　作者：许科伟1，顾　磊1，郑旭莹1，王　彪2,3，郭　鹏2,3