本文摘要：摘要：基因编辑是一种能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。近年来，基因编辑技术不断突破与发展，以CRISPR编辑系统为基础的单碱基编辑和先导编辑引起了科研人员的关注，随着基因编辑技术的不断成熟，已成功应用到各种动、植物以及其他
摘要：基因编辑是一种能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。近年来，基因编辑技术不断突破与发展，以CRISPR编辑系统为基础的单碱基编辑和先导编辑引起了科研人员的关注，随着基因编辑技术的不断成熟，已成功应用到各种动、植物以及其他生物中，为基因治疗和基因功能研究等方面提供了重要的技术支持。本文主要回顾了CRISPR/Cas技术、单碱基编辑技术以及最新开发的先导编辑三项技术的发展历程及应用，并对未来在昆虫中研究的发展和应用作进一步的展望。
关键词：CRISPR/Cas;碱基编辑技术;先导编辑
昆虫作为自然界中数量最多的生物，与农林牧的生产息息相关，科学家们也在不断地对其进行深入的研究，基因组信息是深入研究分子和遗传机制以及进化过程的重要基础。近年来越来越多的昆虫基因组被测序。据统计，2018年12月底在NCBI数据库中已有331个基因组完成组装拼接[1]，截至2020年月日增至497种。随着昆虫基因组信息的日益完善，基因编辑技术的出现为昆虫学的研究开辟了新思路，为昆虫的基因功能研究提供了新的技术支持。经典的基因组编辑工具包括zincfingernucleases(ZFNs)技术[2,3]和transcription activatorlikeeffectornucleases(TALENs)技术[46]，其已在果蝇Drosophila、家蚕Bombyxmori、蟋蟀Gryllulus等昆虫的研究中获得成功[711]。
昆虫研究方向论文：宽带全极化垂直昆虫雷达设计及校准关键技术研究
随后发现了由RNA指导Cas蛋白进行DNA识别及编辑的Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPRassociated(Cas)技术[12]，并广泛应用于临床试验、动植物、细菌、真菌等研究领域[1319]。以上三种基因编辑技术作为功能基因组研究的重要工具在昆虫的研究中已得到了应用[20,21]，为今后进行昆虫功能基因组研究奠定了坚实的基础。为了防止双链断裂(doublestrandbreak，DSB)引起的潜在危害，保证基因组的完整性，近年来，一系列无DSB的单碱基编辑工具——胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditors，CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditors，ABE)和先导编辑(primeediting)已经在多种物种中被广泛开发，并对其编辑技术的精确性及广适性进行了验证。
CRISPR/Cas系统CRISPR/Cas系统最初是由日本大阪大学(OsakaUniversity)于1987年在研究大肠杆菌EscherichiacoliK12体内碱性磷酸同工酶的iap(AlkalinePhosphatase)基因的核苷酸序列时发现的，其中一段由重复短序列间隔排列组成的片段引起了研究者的注意[12]。2002年，Jansen等[22]将这段序列命名为clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)以此来反映这一簇有规则间隔的短回文重复序列的特征，并在研究中确定了四个CRISPR相关基因cas1、cas2、cas3和cas4，cas基因始终位于CRISPR位点附近，说明二者之间具有功能相关性。
研究证明，CRISPR基因座存在于大量细菌和古细菌中[2226]。根据Cas基因核心元件序列的多样性，将CRISPR/Cas系统分为两类六型[27]：第一类是多亚基效应复合物，需要多个Cas蛋白相互作用[2829]，才能发挥CRISPR系统的作用，包括类型、类型III和类型IV，前两种类型在古细菌中出现的频率较高，类型IV较罕见。第二类是单蛋白效应器，该复合物由一个单一的、大的、多结构域的蛋白质组成，CRISPR/Cas位点的组织结构更简单、更统一，其类型包括类型II、类型、类型VI，该类系统中的Cas9、Cas12a(Cpf1)和Cas12b(C2c1)的靶向目标是DNA，Cas13a(C2c2)、Cas13b的靶向目标是RNA。
Cas9基因最早是在2007年噬菌体侵染嗜热链球菌的实验中发现的，研究发现该基因能很好的抵抗噬菌体的入侵，并证实了原核生物已进化出基于核酸的“免疫系统”，其特异性由CRISPR间隔区的含量决定，而抗性由Cas酶机制提供[30]，随后CRISPR/Cas9系统便在动植物等的研究中被广泛应用。在分子水平上，CRISPR的作用过程可以分为三个阶段：整合新的间隔物到CRISPR阵列中，表达和处理CRISPRRNAs(crRNAs)，以及CRISPR干涉[31]。
第一阶段，当外源质粒入侵时，识别PAM(ProtospacerAdjacentmotif)序列，将protospacer与CRISPR间隔序列同源的噬菌体基因序列[32,33]插入到CRISPR位点从而来抵抗入侵的质粒和噬菌体，进而使细胞快速适应环境中的入侵者，因此这个阶段被称为CRISPR功能的适应阶段。其获取间隔物的机制以及CRISPR如何识别噬菌体或质粒DNA是入侵性的尚未明确。第二阶段，一旦在CRISPR位点上建立了一个隔离子，它就为CRISPR通路的防御阶段提供了特异性。这个过程的关键是由重复序列和间隔序列编码的小crRNAs产生。
为了进行成功的防御，该CRISPR阵列被转录生成CRISPRRNA，该RNA作为向导RNA(gRNA)，用于识别与Cas蛋白结合的核糖核酸复合物中的互补外源DNA/RNA，从而降解靶标，阻止入侵。第三阶段，在Cas蛋白复合复的参与下进行靶向和干扰入侵的噬菌体DNA序列[3437]。通过这样的过程细胞成功抵御了噬菌体或质粒的入侵。从2012年CRISPR/Cas9技术正式问世到现在，这一生物技术被广泛应用到人体临床试验、动植物、细菌、真菌等的基因的研究上，解决了众多科学问题。在对果蝇、家蚕、埃及伊蚊Aedesaegypti等昆虫的研究中得到了充分应用[3847]。
通过在ATP依赖的结合盒转运蛋白(白色)中产生一系列框移突变，证明了CRISPR/Cas介导的昆士兰实蝇Bactroceratryoni眼色基因突变，产生经典的白眼表型，为今后开发基因性菌株进行虫害防治提供了可能[48]。利用CRISPR/Cas9系统对棉铃虫Helicoverpazea基因组进行编辑，采用核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物，将合成的gRNA与经过核定位信号设计的纯化Cas9核酸酶结合，从而实现对vermillion眼色基因的高效编辑，实验结果显示胚胎注射或4μMRNP复合物时突变率高，编辑效果更好[49]。
中国科学院上海植物生理学与生态研究所利用CRISPR/Cas9系统构建了亚洲玉米螟OstriniafurnacalisArgonaute1(OfAgo1)突变体，揭示了OfAgo1在亚洲玉米螟角质层色素沉着中的作用[50]。研究发现，以加勒比果蝇Anaststrephasuspensa为研究对象，首先以外源性转基因多聚泛素调控的EGFP(polyubiquitinregulatedEGFP，PUbGFP)为靶点，通过注射Cas9蛋白，实现CRISPR/Cas9介导的基因编辑，使用单个sgRNA进行可遗传的非同源末端连接(nonhomologousendjoining，NHEJ)敲除。
多个缺失突变，从到个核苷酸范围内接近目标位置，通过在转基因果蝇中失去绿色荧光的表型鉴定，这些果蝇也被标记为红色。类似的条件用于内源性别决定基因Astransformer(Astra)，使用两个sgRNAs针对独立的外显子序列671 bp分开。在G0成年果蝇中，根据雌雄间生殖形态学鉴定的体细胞突变频率为81%[51]。
以CRISPR/Cas9为基础，通过卵细胞靶向肽配体(BtKV)与Cas结合注射到烟粉虱Bemisiatabaci雌性成虫卵黄中，可实现对后代基因进行有效且可遗传的编辑，为今后烟粉虱等害虫的防治提供了新的参考防治策略[52]。在不同昆虫中建立CRISPR/Cas9系统，为虫害管理提供了新的视角。2020年月，西南大学马三垣和夏庆友团队利用广谱的piggyBac转座子系统，首次构建了适合于昆虫的CRISPR文库构建策略，并在家蚕细胞系中测试了其效果，结果显示，测试的所有位点的敲除效率都达到了100%[53]。该研究为家蚕和其他昆虫的相关研究和应用提供潜在的靶标，并实现了一系列生物与非生物胁迫的阳性筛选，推动了昆虫基因编辑技术的研究和应用。
2碱基编辑系统
尽管CRISPR/Cas9技术迅猛发展，日益完善，但是传统的CRISPR/Cas9系统主要是通过gRNA的引导，使得Cas9蛋白结合到与gRNA互补配对的DNA链上，对目标基因进行切割形成DNA双链断裂(DSB)，诱发细胞内非同源末端连接(nonhomologousendjoining，NHEJ)和同源重组(homologousrecombination，HR)[54,55]，从而完成对基因的编辑。在编辑的过程中NHEJ与HR存在竞争，NHEJ是一种有效地创制基因敲除突变体的途径，其发生频率较高，但修复方式不够精确，常常在靶点处产生碱基的插入或缺失(insertions/deletions，indels);HR途径是一种较为精确的修复方式，但效率非常低。因此在编辑的过程中往往达不到预期的基因修饰的目的，且不可避免的会对基因组造成损伤[5657]。
碱基编辑是基因组编辑的一种形式，它使一个碱基对在目标基因组位点上直接、不可逆的转换为另一个碱基对，而不需要双链DNA断裂(DSBs)、同源定向修复(HDR)过程或供体DNA模板[58,59]。与引入点突变的基因组编辑方法相比，碱基编辑可以更有效地进行碱基的精准插入和删除以及碱基之间的转换。碱基编辑系统(Baseditor)的诞生在保护了基因组的完整性的基础上提高了编辑效率和精准度，为基因修复提供了更加方便快捷的工具，有力推进了基因组编辑的进程。目前碱基编辑系统依据融合的不同碱基修饰酶分为两类：一类是胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditors，CBE)，另一类是腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditors，ABE)[60]。
3先导编辑(primeediting)
2019年11月，DavidR.Liu团队在原有的基因编辑技术的基础上开发了一种新型的基因编辑技术——先导编辑[115]，此项技术相比于同源性导向的修复，提高了编辑效率以及产品纯度;相比于碱基编辑，具有互补性优势，实现了碱基之间的颠换;在已知的Cas脱靶位点上，提供了比Cas核酸酶更低的脱靶率。先导编辑技术大大扩展了基因组编辑的范围和能力，原则上可以纠正大约89%的人类已知致病性基因变异。先导编辑主要的复合物包括Cas9酶(被修饰成仅切割DNA的一条链)、逆转录酶(以RNA为模板产生新的DNA链)，此外还需要一种特殊的gRNA——pegRNA(primeeditingguideRNA)，这种pegRNA不但能够结合想要编辑的特定DNA区域，还会自带“修改模板”，从而在精确编辑中发挥作用。
即pegRNA将编辑信号发送到靶标处，引导Cas9切割DNA的一条链;随后反转录酶读取RNA并将相应的碱基连接到被剪切的DNA链的末端，与此同时将编辑序列从pegRNA转移到靶标DNA上;细胞中的核酸内切酶切除旧的DNA片段，将新的碱基组合到基因组中;此时靶标位点只剩下一条已编辑的链和一条未编辑的链;为解决错配问题，有利于已编辑过的DNA永久安装，一个不同的gRNA指引Primeeditor去剪切未编辑的链;剪切产生的缺口提示细胞以编辑过的链为模板，重新生成新的链，最终完成编辑[116]。
4碱基编辑系统的发展前景
2017年碱基编辑技术被Science杂志评为全球时代年度科学突破之一，2020年美国科学院公布未来10年农业发展的五大方向中的“突破性的基因组学和精准育种技术”是以基因编辑技术的发展应用作为核心技术导向，由此可见基因编辑系统的发展具有巨大的潜力。
随着CRISPR/Cas技术、胞嘧啶碱基编辑技术、腺嘌呤碱基编辑技术、以及最近研发的先导编辑系统等基因编辑工具的不断更新，编辑的范围从原有的低精确度，到实现单碱基的转换，再到可实现任意碱基之间的替换，不断改进的过程，indels也不断降低，让我们更加的坚信在未来的基因治疗、基因功能鉴定等方面会向着更加精准化、有效化的方向展开，并将其应用在动植物，尤其是昆虫的防治中去。碱基编辑技术在昆虫中应用，将为害虫管理提供新的研究方向，以维持生态平衡为前提对有害生物等进行有效防控，减少对农业经济的不利影响，保证农林牧等产业的稳定发展。
参考文献
[1]黄聪,李有志,杨念婉,等.入侵昆虫基因组研究进展[J].植物保护,2019,45(5):112120.
[2]ChooY,KlugA.TowardacodefortheinteractionsofzincfingerswithDNA:selectionofrandomizedfingersdisplayedonphage[J].roceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1994,91(23):1116311167.
[3]ChooY,KlugA.SelectionofDNAbindingsitesforzincfingersusingrationallyrandomizedDNArevealscodedinteractions[J].roceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1994,91(23):11168111672.
[4]BonasU,StallRE,StaskawiczB.GeneticandstructuralcharacterizationoftheavirulencegeneavrBs3fromXanthomonascampestrispv.vesicatoria[J].MolecularandGeneralGeneticsMGG,1989,218(1):127136.
作者：王晓迪，冀顺霞，申晓娜，刘万学，万方浩，张桂芬，吕志创
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