高工论文石油解混合菌对土壤影响

　　石油对土壤的污染如何处理呢?本篇高工论文提供了石油烃降解混合菌改善修复稠油污染土壤的技术，分析修复过程中的影响因素，以为污染土壤修复提供技术支持。可以发表高工论文的期刊有《污染防治技术》2001年镇江市环保局根据科技部有关规定不再参与主办工作，由江苏环境科学学会独家主办。是江苏省环保科技重点刊物，创刊十六年来，以其浓厚的科技内涵和专业特色，受到广大环保科技人士的欢迎和好评。获奖情况：2001年被评为江苏省一级期刊。

　　1石油烃的测定方法

　　石油烃的浓度依据“GB/T16488-1996水质石油类和动植物油的测定红外分光光度法”进行。将含有菌液的原油无机盐培养基转移至250mL分液漏斗中，利用1mol•L-1的盐酸使其酸化至pH≤2，用20mL环保专用CCl4洗涤三角瓶，洗涤液也加到分液漏斗中，然后加入2g氯化钠破乳，充分振荡3min后，静置5min待其分层，将萃取溶液转移至一新的三角瓶中，用CCl4萃取，重复操作2次，合并3次的萃取液。将15mm厚的无水Na2SO4(300℃烘干2h)平铺于玻璃砂芯漏斗内，萃取液缓慢通过砂芯漏斗除去其中的水分，随后用真空泵将滤液抽至抽滤瓶中，用适量CCl4洗涤砂芯漏斗，洗涤液也转移至抽滤瓶中。将抽滤瓶中的滤液移至100mL容量瓶中，用CCl4定容至刻度、摇匀。并用OIL510型全自动红外分光测油仪测定石油类含量，并计算石油烃的降解率。

　　2结果与讨论

　　2.1修复方案的比较

　　麦糠的添加量为土壤体积的20%，加水后的土壤含水量为25%，外源菌的投加量为土壤质量的10%。利用NaNO3调整土壤的初始N含量为0.6%，利用K2HPO4•7H2O调整土壤的初始P含量为0.2%，土壤的初始pH调整为8.0，混合菌液接种量为50mL，菌液的细菌浓度维持在108～109CFU•mL-1。在添加营养元素、水分、膨松剂适宜的条件下，投加石油烃降解混合菌KL9-1，可明显改善修复效果，经过70d的微生物修复后，方案4的石油烃降解率可达51.02%，后续的修复效果影响因素分析以方案4为基础进行。

　　2.2修复过程中的影响因素

　　2.2.1初始pH的影响调节稠油污染土壤的初始pH，使其分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10，每10d取1次样，测定在不同pH下的石油烃降解率，以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照实验。图2为不同初始pH对混合菌KL9-1修复稠油污染土壤效果的影响。由图2可以看出，混合菌KL9-1在土壤初始pH为6.0时，修复效果相对较差。当初始pH为8.0时，通过70d的微生物修复，石油烃的降解率可达53.13%。当初始pH为10.0时，通过70d的微生物修复，土壤中石油烃的降解率只有38.27%。微生物的生化反应都需要酶的参与，而酶反应需要合适的pH范围，如果土壤初始pH过低或过高，可引起微生物的原生质膜所带电荷发生变化，抑制细胞酶的活性及向胞外分泌，从而降低土壤中的石油烃生物降解速率。

　　2.2.2接种量的影响每个花盆中设定菌液接种量分别为10.0mL、30.0mL、50.0mL、70.0mL、90.0mL，细菌数为108～109CFU•mL-1，每10d取1次样，测定在不同混合菌接种量下的石油烃降解率，以不接种混合菌剂，不添加表面活性剂和N、P营养作为空白对照实验。由图3可以看出，混合菌KL9-1的添加可以明显改善土壤的修复效果，因此在土壤的生物修复过程中，仅靠土著微生物的降解难以达到较好的效果。研究表明〔11〕，通过添加高效外源菌剂可使石油去除率提高，并能缩短修复时间。接种量低于30mL时，由于微生物数量不足，石油烃浓度相对于细菌数量来说过高，因而会对细菌的生长产生抑制作用，土壤的修复效果较差。当接种50mL时，石油烃的降解率达到53.69%。当接种量为90mL时，石油烃的降解率为38.91%，可能是因为微生物密度过大供氧不足导致降解率下降，从而使反应速率降低。混合菌KL9-1修复的最佳接种量确定为50mL。

　　2.2.3氮磷营养的影响利用K2HPO4•7H2O调整土壤的初始P含量为0.2%，利用NaNO3按N∶P为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例调整土壤中初始N含量，10d取1次样，测定不同N/P下的石油烃降解率。以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照实验。土壤中不同的N/P对石油烃降解率有一定的影响。实验所用的土样为克拉玛依地区的土壤，N、P含量较低，如果不添加N、P营养物质，微生物的生长会受到抑制，因而会影响土壤的修复效果，经过70d生物修复后，石油烃降解率仅为13.52%;而按照一定比例加入N、P营养元素后，石油烃的降解率提高，这是因为适量比例N、P的添加能够促进微生物的生长，从而改善土壤的修复效果。一般认为C∶N∶P为100∶10∶1时最适于烃类污染物的生物降解〔12〕。实验结果表明，当N∶P为2∶1时降解效果最好，土壤经过70d修复后，其石油烃的降解率可达53.16%，但如果再继续提高N、P，石油烃的降解率反而会下降，说明混合菌KL9-1的生长对N、P营养源的要求较高，不合适的N/P会抑制混合菌KL9-1的生长，从而使石油烃的降解率下降。

　　2.2.4表面活性剂的影响向花盆中分别加入Tween80表面活性剂2g、4g、6g、8g、10g，每10d取1次样，测定加入不同量的表面活性剂石油烃的降解率，以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照。在石油污染土壤中的生物修复过程中，石油中的主要烃类化合物具有憎水性，是影响微生物代谢、降解的主要问题。表面活性剂可以促进石油的乳化，使之在土壤的水相中分散，增加两相间的界面面积。在进行石油污染土壤的生物修复时，选择表面活性剂需要满足〔11〕:①对微生物和其他生物无毒害、无副作用;②易被生物降解;③能够提高污染物的生物降解性;④不会造成土壤物理性质恶化。阴离子表面活性剂的加入有助于碳氢化合物从土粒表面解脱进入液相，改进憎水性有机化合物的亲水性和生物可利用性，有利于细菌降解碳氢化合物。随着表面活性剂Tween80添加量的增大，土壤中石油烃的降解率也逐渐增大，当表面活性剂的添加量为6.0g时，修复70d后的石油烃降解率可达53.92%，当添加量超过6.0g时，随着表面活性剂用量的增加，土壤中石油烃的降解率会下降，说明尽管Tween80的毒性作用相对较小，但含量过高仍会对微生物生长和活性有抑制作用，这也说明石油类物质降解的复杂性。

　　2.2.5翻耕频率的影响各实验组分别设置为1d、2d、3d、4d及5d翻耕1次，每10d取样1次，测定在不同翻耕频率下的石油烃降解率，以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照实验。由图6可以看出，翻耕频率的不同明显影响混合菌KL9-1对稠油污染土壤的修复效果，正是因为翻耕可以保证土壤中的水分、氧气及微生物在空间和时间上分布的均匀性。在翻耕过程中，空气中的氧气进入土壤，同时土壤内部代谢产生的CO2被释放出来，从而保证微生物生长代谢过程中有充足的氧，因此适当提高土壤的翻耕频率，可以改善土壤的微生物修复效果。当翻耕频率为每2d1次时，经过70d的修复，土壤中石油烃的降解率可达54.07%，但翻耕频率为每天1次时，石油烃的降解率却有所下降，这可能是因为过频繁的翻耕影响混合菌群之间的协同作用，从而影响了石油烃的分解。

　　2.2.6浇水频率的影响各实验组分别设置为1d、2d、3d、4d及5d浇水1次，每10d取样1次，测定在不同浇水频率下的石油烃降解率，以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照实验。水对微生物的生长代谢有重要的影响，土壤中微生物数量及活性与土壤含水量有密切的关系。当土壤中含水量过低时，主要从两个方面影响土壤修复效果，第一是微生物的生长代谢受到抑制，因此会降低土壤中微生物的数量及活性。另外就是土壤中的营养物质和污染物质的传质速度会大大降低，生物可利用性变差，不利于生物修复的开展，特别是在沙漠和荒漠地区〔13〕。由图7可见，浇水对降解率的影响很大，在40℃高温条件下，5d浇水1次时降解率很低，这是因为高温条件下水分蒸发较快，微生物得不到充足的水分供应而无法生长，因此土壤中整体代谢速率降低，从而影响修复效果。由图5～6还可以看出，土壤中如果含水率过高也会影响石油烃的降解率，这是因为土壤的有效毛细孔隙被水充满，妨碍了空气的传递，造成土壤中氧的供应不足，从而抑制了微生物的生长及石油烃的降解。由图7可知，当每2d浇水1次时降解率最高，可达53.62%以上。

　　2.2.7膨松剂对石油降解的影响实验所选用的膨松剂为稻壳、干草、麦麸及玉米秸秆，共设4组花盆实验，每组实验做3个平行。每个花盆分别加入30.0g稻壳、干草、麦麸或玉米秸秆，每10d取样1次，测定在添加不同膨松剂情况下的石油烃降解率。以不接种菌剂，不添加表面活性剂和N、P作为空白对照。土壤颗粒具有一定的黏性，容易聚合结成块状，从而导致土壤颗粒的孔隙率减小，不利于土壤中水分的保持及空气的流通，添加膨松剂能在一定程度上克服上述问题。研究表明〔14-15〕，在生物修复过程中加入牛粪、农作物茎秆、壳质素、锯末及腐殖酸等有机物，可提高土壤的总体积，增加土壤的孔隙率，有利于增强土壤中水分的保持及空气的流通。由图8可以看出，当稻壳作为膨松剂添加到土壤中时，经过70d的修复，石油烃的降解率最高，可达53.73%，这是因为在质量相同的情况下，稻壳的尺寸相对于其他几种膨松剂要小，比表面积更大，因此可使土壤的孔隙率变得更大，且较大的比表面积可吸附更多的石油烃，水土保持的能力更强，从而微生物生长代谢旺盛，有助于石油烃降解率提高。

　　3结束语

　　以自然放置、营养+水分、营养+水分+麦糠以及营养+水分+麦糠+外源菌KL9-1这4种方式进行土壤修复，土壤中的石油烃降解率依次提高，其中以营养+水分+麦糠+外源菌的方式修复效果最好，经90d的实验，土壤中石油烃的降解率为51.02%，表明接种混合菌KL9-1对稠油污染土壤的修复是有效的。混合菌KL9-1的单因素实验研究表明，pH、接种量、土壤N/P、表面活性剂用量、翻耕频率、浇水频率和膨松剂种类等对修复有明显的影响，在每千克稠油污染土壤的体系中，控制初始pH为8.0，接种量为70.0mL，N∶P=3∶1，表面活性剂用量为4.0g，每2d浇水1次，每4d翻耕1次，在此条件下，经过70d的生物修复，石油烃降解率最高可达54.07%。但现场实验与花盆实验有较大差异，如土壤中水分的蒸发量就受光照强度等天气因素的影响，因此现场修复要考虑这些因素的变化，而不是简单的固定翻耕频率及浇水频率。

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