组织透明化技术的研究与应用

　　摘要背景：对生物体进行全身细胞分析是生物医学领域的主要挑战之一。组织透明技术结合光学成像和图像处理技术，能够将整个器官或全身快速透明并进行结构和细胞分析，为在生命科学中应用先进的光学技术提供了一个非常有前景的解决方案。目的：分析组织透明技术原理及过程，总结组织透明技术研究进展，介绍组织透明成像技术，讨论组织透明技术在生物医学研究领域中的应用。方法：第一作者以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging，3Dimaging”为关键词，检索PubMed数据库发表的相关文献，初检文献168篇，系统整理、筛选后，对纳入的72篇文献进行分析、总结和讨论。

　　结果与结论：目前组织透明技术主要分为两类，有机溶剂透明技术和亲水性试剂透明技术，组织透明步骤包括：①组织固定;②透化作用;③脱色作用;④折光率匹配。组织透明技术能够使组织快速光学透明，显著提高成像深度和图像对比度，结合显微成像技术如共聚焦显微镜、双光子显微镜和光片显微镜等，能够在单细胞水平实现全身或全器官的高分辨率三维成像，加速了生物体全身细胞分析进程。未来，组织透明技术将会持续发展，并将推动新型透化试剂和透化专用显微镜的研发，从而加强从完整机体系统获取结构和分子信息，有助于对完整生物系统的综合理解。

　　关键词：组织透明技术;三维成像;全身细胞分析;光散射;折射率匹配;显微成像技术

　　0引言

　　Introduction从复杂的生物体中提取详细的结构和分子信息，同时保留理解系统功能所需要的全局视角是疾病研究的关键，也是生物医学研究领域的根本性挑战。通过对完整生物机进行全面系统的分析，可以获取诸多有价值的结构相关信息，对于肿瘤及神经系统等疾病的治疗及发病机制的研究极为重要。计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和近红外成像等先进成像技术的发展及应用，揭示了活体动物的解剖结构，但是由于缺乏高对比度的细胞标记工具，这些成像技术无法实现单细胞的特性分析。传统组织学技术能对固定组织中的细胞进行空间表型分析，但需要进行组织连续切片和图像重建，费时费力，并且在图像重建过程中容易出现结构信息丢失[1-2]。

　　全自动切片技术的发展极大程度地节省了人力和时间，目前结合分子标记技术，已成功绘制出啮齿类动物大脑结构图[3]。但是这种精细的结构重建通常只适用于体积较小的组织。双光子显微镜的发明打破了传统显微镜成像深度为100μm的限制[4]，使组织成像深度增加至几毫米[5]，但是生物组织的高度不透明性限制了这些技术的应用，随着光向深层组织的传播，成像分辨率和对比度也会随之降低，因此仍然无法实现较大组织或器官的完整三维像。减少生物组织的光散射和光吸收是增强光学成像深度的有效解决方案[6]，White利用育种技术制作出一条透明的成年斑马鱼，该模型已经被用于实时研究癌症的病理变化和发展[7]，但这种方法不适用于人类或其他动物的研究。

　　近年来组织透明技术的发展促进了生物体三维成像的进程，组织透明化技术是通过对样本进行固定、透化、折光率匹配等处理，使组织变得光学透明，降低样本的光散射和光吸收，从而增加成像深度及对比度[8]。在保持组织结构完整前提下，组织透明技术能实现细胞水平的三维成像，避免了空间结构信息的丢失，因此组织透明技术是打开光学显微镜潜能的关键技术，也是绘制全器官或全身细胞图谱的最佳选择方案之一。文章目的在于综述近年来组织透明技术的研究进展，介绍组织透明技术与显微成像技术的联合应用，讨论组织透明技术在生物医学研究领域中的应用进展及研究意义。

　　1资料和方法Dataandmethods

　　1.1资料来源

　　第一作者利用PubMed数据库，以“tissueclearingtechnique，tissueopticalclearing，whole-bodyimaging,3Dimaging”为关键词，检索1914年至2019年发表的相关文献，初检文献168篇。

　　1.2纳入标准纳入与组织透明技术及应用相关的外文文献，包括研究原著、综述、论著等。

　　1.3排除标准重复性研究。

　　1.4数据提取PubMed数据库初检文献116篇，阅读题目、摘要进行初筛，阅读全文进行二次筛选，最终保留文献72篇。

　　1.5质量评估

　　最终保留的72篇文献，符合纳入标准，适合用于后续分析、总结。

　　2结果Results

　　2.1组织透明技术原理及过程

　　生物组织的不透明性是由不同光学特性的非均质成分造成的，如折射率(RI)和光吸收率，大多数生物组织由高折射率的散射粒子，如脂质、蛋白、髓鞘，弹性纤维，以及低折射率的周围介质，如细胞间质液和细胞质共同组成的。由于每种成分具有不同的折射率，这种非均质物质结构会使入射光发生散射，限制了光学成像深度[9]。此外，内源性色素如血红素、核黄素、黑色素和脂褐素的光吸收也会使光传播衰减[10]。因此改变组织非均质成分的光学特性，降低光散射和光吸收是增加组织成像深度的关键。

　　1个世纪前，SPALTEHOLZ[11]首次引入3D组织标本的透明原理，在此研究基础上，GENINA等[12]将组织浸入光学透明剂中平衡折射率，使组织变得更加透明，进一步增加了成像深度。随着光学显微镜的发展和普及，以及数据采集和存储技术的进步，组织透明技术使全器官甚至全身成像成为可能，近年来研究人员开发出一系列组织透明技术，所有透明技术都致力于平衡组织折射率，以减少光散射的不均一性。

　　组织透明技术过程：尽管目前存在大量的组织透明技术，但它们主要包括以下2-4个步骤[13]：①组织固定;②透化处理;③脱色;④折光率匹配。组织固定是组织透明过程中保存目的蛋白和分子的关键步骤，常用的固定方案包括多聚甲醛PFA固定，水凝胶包埋，戊二醛固定等。透化作用是促进高折射率介质向深层组织渗透的重要环节，目前常用透化试剂包括三类：①水溶性有机溶剂;②高水化试剂;③脱脂试剂。脱色是实现全器官透明的必要步骤，因为内源性色素会衰减光的传播，干扰观察。折射率匹配是利用高折射率介质平衡透化组织的折射率，使整个组织折射率均匀化。

　　2.2组织透明技术分类

　　目前组织透明技术主要分为两类：有机溶剂透明技术和亲水性试剂透明技术。

　　2.2.1有机溶剂透明

　　有机溶剂透明技术主要是应用含有高折射率介质的光学透明剂取代组织中水分和脂质来平衡组织折射率，使组织达到光学透明。透明方案包括2个步骤：①脱水/脱脂;②光学透明剂浸透。高折射率介质与水不混溶，因此需要应用有机溶剂进行组织脱水，脂质是光散射的主要来源，脂质双分子层决定细胞膜的通透性，因此，组织脱水后必须进行脱脂处理，以促进光学透明剂向深层组织渗透。SPALTEHOLTZ[11]首次应用有机溶剂透明组织样本，制作出光学透明器官，推动了解剖学的发展进程。DODT小组[14]在此基础上进行改良，采用乙醇脱水，BABB脱脂，透明完整小鼠胚胎和新生小鼠大脑，结合光片显微成像技术，对完整海马进行三维图像，获得了CA1神经元树突树和树突棘在细胞分辨率水平的三维图像。

　　但是，苯甲醇-苯甲酸苄酯(BABB)透明最大的缺陷是乙醇脱水会导致内源性荧光蛋白淬灭，为了解决这一问题，ERTÜRK小组[15]应用四氢呋喃孵育代替乙醇脱水，保护绿色荧光蛋白(GFP)信号，同时应用二苄醚(DBE)替代BABB以提高透明效率，开发出基于四氢呋喃和DBE的新型透明方案3DISCO。3DISCO能够快速透明多种器官组织，包括小鼠大脑，肺脏，肿瘤及人类胚胎等[16-18]，并有效延长了绿色荧光蛋白的表达时间。为了充分保存内源性荧光蛋白，RENIER团队[19]结合3DISCO透明，建立了一种全组织包埋免疫标记的三维成像技术iDISCO，应用免疫标记实现目的蛋白的可视化。

　　iDISCO通过组织脱水脱脂，增加抗体渗透性，能够对小鼠胚胎及成年小鼠组织(如肾脏，大脑)进行可视化三维免疫标记，结合AAV2病毒示踪，iDISCO展示了视神经损伤后神经退变及再生的三维成像。虽然3DISCO能够保护内源性荧光蛋白，但是DBE的降解产物如过氧化物或醛类物质，会对荧光蛋白产生有害干扰，荧光蛋白信号仅能维持几天，为了克服这一缺陷，Dodt引入抗氧化剂没食子酸丙酯抑制DBE降解产物的积累，设计出sDISCO透明方案，高效透明组织样本的同时，有效保存透明样品的荧光信号和组织结构，结合STED，树突棘结构清晰可见[20]。

　　为了更有效地保存内源性荧光蛋白，ERTÜRK小组开发出一种基于DPE的透明技术uDISCO，可以高效透明啮齿类动物及临床人类标本[21]，有效保存荧光蛋白信号长达数月，结合显微成像技术，uDISCO能够完成小鼠全身血管生成的三维成像，此外，uDISCO可以与多种标记技术兼容，如病毒示踪和免疫染色[21]。但是对于绿色荧光蛋白表达水平较低的样品，uDISCO保存荧光蛋白信号的能力并不理想。朱丹课题组在uDISCO基础上，调整试剂pH值，推出改良透明方案a-uDISCO[22]，能够更好地保留绿色荧光蛋白荧光，并且以高质量成像展示了整个小鼠大脑神经元网络，a-uDISCO是绿色荧光蛋白低表达样品成像的优先选择。为了增强荧光蛋白信号强度，CAI等[23]随即开发出一种基于纳米体的全身免疫标记技术vDISCO，纳米体标记显著提高了荧光染料对大型组织的标记效率，使荧光信号强度增强100倍，因此能够对透明小鼠进行从头到脚的光学成像和亚细胞水平的量化分析。

　　结合光片显微，ERTÜRK团队首次构建出成年小鼠神经元全身投射图，并揭示了急性中枢神经系统损伤后远端神经末梢的投射变化和炎症过程。虽然uDISCO能够透明大部分小鼠器官，但是对肝脏、脾脏等器官以及硬组织的透明效果欠佳，为了提高全身透明效率，赵瑚团队开发出一种基于聚乙二醇(PEG)的新型全组织透明技术PEGASOS[24]，通过脱钙，脱色，脱水，脱脂等优化处理，该透明技术首次实现了对动物软、硬组织的同时透明化，包括骨骼、牙齿、大脑、肌肉等，结合Thy1-EGFP转基因小鼠，赵瑚团队对完整脊柱进行三维成像，展示了脊髓神经纤维走行以及DRG与脊髓的连接关系。基于有机溶剂的透明技术在透明动力学上具有一定的优势，能快速高效透明多种类型组织样本。但是有机溶剂透明会导致样本大幅度皱缩，对组织结构和蛋白具有潜在的破坏性;此外有机溶剂具有一定的毒性和腐蚀性，需要特殊防护，并且需要特殊物镜进行成像，限制了其广泛应用。

　　2.2.2亲水性试剂透明

　　由于有机溶剂透明存在一定的局限性，许多研究人员开始寻求基于亲水性试剂的透明方案。目前，亲水性试剂透明主要包括2种：单纯浸泡透明和高水化脱脂透明。

　　2.3组织透明成像技术

　　目前显微成像技术正在以惊人的速度发展，这些显微成像技术包括共聚焦显微镜、双光子显微镜，光片显微镜和光学相干断层扫描等[47-48]。其中双光子显微镜最适合用于非透明组织的深部成像。然而组织透明技术去除了光散射造成的穿透限制，这将意味着成像深度不再受样本的限制，而是受物镜的限制，目前应用于透明组织光学成像技术主要包括以下几种：

　　2.3.1共聚焦和双光子显微镜成像

　　组织透明成像的主要限制因素是物镜工作距离，而不是光的穿透，因此大轴向行程的立式显微镜对于适应较长工作距离的物镜和较厚样品是必不可少的。目前大多数显微镜制造商都推出了超长工作距离(>5mm)和高NA(>0.9)的物镜，所以共聚焦显微镜和双光子显微镜都可以用于透明样品成像。对于多种染料标记的样品，共聚焦成像会产生更好的信噪比，因为单光子激发效率较高，交叉激发可能性低，此外，由于激光之间的快速切换(无需调谐)，可以更快地获得多色共聚焦图像。

　　双光子显微镜在进行较厚组织Z轴扫描时，能够防止焦平面以外的区域发生光漂白作用，此外应用近红外光作为激发光源，具有更强的组织穿透能力，因为即使透明样本也会存在一定程度的短波散射[49]。然而，双光子和共聚焦成像技术最主要的局限在于成像速度，激光扫描是一个耗时缓慢的过程。使用20X/1.0NA物镜扫描整个体积为1000mm3的小鼠大脑，即便以相对较快的扫描频率1hz进行扫描，也需要将近50d[50]。因此，对于透明组织，双光子和共聚焦成像只适用于较小区域的高分辨率成像。

　　2.3.2光学投影断层成像

　　光学投影断层成像通过收集样品不同角度的透射投影图像，重建样本三维信息，能够对厘米尺度的样本进行快速明场和荧光的三维成像，是大体积生物标本成像的理想选择之一[51]。目前光学投影断层成像已广泛应用于神经科学领域，研究胚胎发育及全脑神经网络连接等。结合组织透明技术，光学投影断层成像成功检测了多种组织类型样本，包括发育中的小鼠胚胎、异种移植瘤组织、小鼠整个心脏、肾脏、大脑半球以及白色脂肪组织[52-53]。最近，BAN等[54]开发出无需组织标记的光学投影断层成像(LF-OPT)，LF-OPT采用衰减对比度进行成像，因此无需任何荧光或染料标记即可实现对普通胚胎的三维成像，扩大了光学投影断层成像的应用范围。

　　2.3.3光片显微镜成像

　　组织透明成像技术推动了光片显微镜的再发展[9]，光片显微镜应用激光光束从侧面激发荧光样品，并通过垂直CCD来获取检测成像，由于激发与检测路径是分离的，且单个x-y平面图像在一次扫描中获得(无需线扫描)，所以可以将光漂白和光学损伤降低到最低。相机读取速度以及焦平面移动速度是采样时间的主要限制因素，LSFM结合sCMOS相机，拍摄速度高达100帧，因此LSFM能够实现大体积样本的高速、高信噪比成像[32，55]。这些优点满足了系统生物学的研究要求，诸多实验将光片显微镜用于全器官成像，包括对动物胚胎发育的时空监测[56]，鱼和苍蝇全脑神经活动的功能成像[57]，或者小鼠全脑成像[58]。综上所述，LSFM是以高通量方式获取透明组织3D成像的最佳途径之一。

　　2.4组织透明技术在生物医学研究领域的应用

　　组织透明化技术的发展使大型生物样本变得透明，为生物组织结构的三维可视化打开了大门，并为进一步探索人类疾病的复杂性提供了崭新的平台，近年来组织透明技术在生物医学研究领域得到了广泛应用。

　　3讨论Discussion

　　组织透明技术可以将完整组织或器官转化为光学透明形式，结合显微成像技术，极大推动了体积成像(全身或全器官成像)的进程，有助于加强对完整生物系统的综合理解，为生物医学研究领域提供了强有利的工具。近年来，组织透明技术发展迅速，多种新型透明技术不断涌现，不同的透明技术具有特定的组织适用性，研究者应该根据实验目的，选择合适的透明方案。有机溶剂透明优势在于透明质量和速度，因此更适合全身或者大器官透明，uDISCO和PEGASOS均可高效透明整个小鼠身体[21，24]，并且能够保存内源性荧光蛋白长达数月，因此是全身透明的首选方案;基于亲水性试剂的CUBIC-2通过脱钙、脱色等优化处理也可以有效透明小鼠全身[41]，基于水凝胶包埋的ACT-PRESTO虽然可以透明小鼠全身[70]，但透明效果欠佳，并且需要特殊设备，因此不适合用于全身透明。

　　亲脂性染料如DiI是常用的神经示踪剂，在神经环路研究中发挥重要作用，SeeDB，FRUIT，Scale等透明方法[25，27-28]，操作简单，成本低廉，脂质成分保存完好，与亲脂性染料有较好的兼容性，但是透明效率较低，只适合组织片或小样本DiI染色的透明，相比而言，SWITCH和ScaleS具有较高的透明效率[26，37]，同时能够保留亲脂性染料，因此是大样本透明的首选。

　　基于凝胶包埋的透明技术，如CLARITY，PACT-PARS，SWITCH，SHIELD[29，33，38，59]，通过共价交联作用，能够有效保护组织结构，生物分子以及RNA，因此可以进行RNA转录本分析以及应用透射电镜进行超微结构分析，但是对硬组织的透明效果不理想，如骨骼、牙齿。综上所述，没有一种单独的透明技术能够满足所有实验需求，研究者需要根据组织样本的类型、体积以及成像需求选择最优的透明方案。虽然组织透明技术发展迅速，但是目前仍然面临一些挑战，阻碍了体积成像技术的大规模应用。首先是透明速度和质量，目前组织透明技术主要集中在啮齿类动物，对于灵长类动物或人类标本的透明还局限在组织切块水平，并且透明时间较漫长，目前还没有实现完整狨猴大脑的透明，未来应该着重开发更加高效、无毒的透明试剂，以提高灵长类动物组织的透明质量和速度。

　　其次，抗体染色深度是组织透明技术的主要挑战之一，由于抗体和荧光基团分子量较大，在组织中的渗透速度缓慢，因此需要较长的孵育时间，此外，抗体在深层组织的扩散和结合呈现非线性，导致组织染色不均匀。虽然AbScale，PACT-PARS，ACT-PRESTO，Ce3D等透明方法能够显著提高抗体渗透速率[26，44，70-71]，但染色深度也只局限在几毫米，无法实现完整器官的三维免疫标记。使用单域抗体、核酸适配体或者纳米体应该能提高组织渗透性和染色均匀性，vDISCO应用纳米体代替传统抗体，显著提高了样本标记效率，并实现了对Thy1-GFP小鼠完整神经投射的标记[23]。但是目前纳米体种类较少，未来有待于开发更多类型的纳米体，同时结合微波技术或电泳技术，增强对生物体的三维免疫标记。

　　此外，成像深度和分辨率也存在一定的限制，超长工作距离和高NA的物镜是体积成像必不可少的，光片显微镜LSFM拥有工作距离>5mm，NA>0.9的物镜，但物镜放大倍数有限(1.26x-12.6x)[5]，极大限制了图像分辨率，因此急需开发透化专用的超长工作距离高倍物镜，加快实现亚细胞分辨率的体积成像。自适应光学可能会促进体积成像的进程，目前自适应光学已广泛用于天文学中大气光散射的纠正，这种技术通常是基于传感器来检测返回光波阵面的变形，并通过变形反射镜或空间光调制器来纠正这些变形，目前正被应用于显微镜成像，以提高光在非透明样品中的穿透深度[72]。

　　虽然自适应光学本身在较深组织内并不能产生清晰的图像，但当与组织透明技术相结合时，成像深度和分辨率可能会大幅度增加。除了成像限制，后期大容量图像数据集处理也存在一定的挑战，需要使用具有大容量内存和专业软件的专用工作站，同时，处理和分析超大数据集的新型开源解决方案有待于进一步开发，以便更好地理解这些成像方法所揭示的细胞之间的复杂关系。未来组织透明技术将会继续发展，新型透明试剂、免疫标记、显微镜设计以及大型数据集分析等方面的技术进步将为生物医学科学家绘制全身单细胞图谱铺平道路。

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