本文摘要：摘要：从鳗鲡肠道中筛选出一株具备高效降解亚硝酸盐与硝酸盐和安全的优良芽孢杆菌B1，经过16SrRNA序列分析与生理生化检测，鉴定为地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)。该菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧条件下培养24h，亚硝酸盐由85.61mg/L降低至0.47mg/L，
摘要：从鳗鲡肠道中筛选出一株具备高效降解亚硝酸盐与硝酸盐和安全的优良芽孢杆菌B1，经过16SrRNA序列分析与生理生化检测，鉴定为地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)。该菌株在葡萄糖10g/L，28℃好氧条件下培养24h，亚硝酸盐由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率99.45%;硝酸盐由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，氨氮由52.74mg/L降至18.71mg/L，降解率为64.52%。在模拟处理养殖水体，接种终浓度为106CFU/mL菌株B1后，3d后亚硝酸盐浓度由5.15mg/L降低至0.41mg/L，降解率达92.04%，5d降解至0.09mg/L，达到养殖水体标准;鳗鲡在含菌株B1终浓度为108CFU/mL水体，15d无明显病理变化。试验结果说明：鳗鲡肠道原籍菌株B1具有高效的硝化与好氧反硝化的能力，对水产养殖动物安全、无副作用。研究结果表明，菌株B1有助于水产养殖水体的生物脱氮或含高浓度氮的废水处理，具有良好的微生态开发应用前景。
关键词：地衣芽孢杆菌;亚硝酸盐;硝酸盐;脱氮能力;好氧反硝化
随着水产养殖行业的快速发展，养殖规模不断扩大与养殖密度趋向集约化，加上传统的静水、高密度与高投饵的饲养模式，导致养殖水质污染问题越来越 严重，尤其亚硝酸盐污染[1]。研究表明，当养殖水体中含氮物质的生成量超过水体自然菌群的代谢降解速率，则含氮物质不断沉积于池底，这也是亚硝酸盐等有害物质不断累积的主要原因[2，3]。亚硝酸盐通过鱼的鳃进入体内，导致体内亚硝酸盐含量过高[4]，血液中Fe2+被氧化成Fe3+，导致血液运输氧气能力减弱或散失，从而诱发鱼病，甚至导致大量的水产动物死亡[5-8]。
养殖方向评职知识：水产养殖方面有什么学术型论文文献
亚硝酸盐由氨转化而来，再经过硝化细菌利用转变为硝酸盐[9]，硝态氮(NO3-)最后经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气(N2)进入大气中;但硝化细菌繁殖速度较慢，约18h一代，而亚硝酸盐转化为硝酸盐所需时间较长[10]，导致亚硝酸盐的积累。传统反硝化细菌的反硝化作用需要厌氧环境才能发挥作用，而在水产高密度养殖中往往需要通过增氧来保证有足够的溶解氧，这导致厌氧反硝化细菌的反硝化作用就无法正常发挥作用。
好氧反硝化可以无需厌氧就能有效地降低养殖水中硝酸盐含量，既不受约于养殖水体中的溶氧同时又能降低硝酸盐含量，因此，寻求一种既能快速降解亚硝酸盐，又能在有氧条件下进行反硝化作用的菌株，显得十分重要，受到越来越多的学者关注和研究。随着国内外学者的不断研究，已经分离多株具备好氧反硝化的菌株，并对它的脱氮能力进行研究[11-15]，如一类好氧或兼性好氧的芽孢杆菌属(Bacillus)[16]、假单胞菌属(Pseudomonas)[17]等可以在有氧条件下进行反硝化作用。
其中芽孢杆菌具有繁殖速度快、可形成芽孢、生命力强、生长代谢过程可产生多种酶类、可降解水体中有机质，可更好地达到净化水质效果[18]，杨艳等[19]采用巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)改善养殖水体，亚硝酸盐含量显著降低;熊焰等[20]与高海英等[21]分别从养殖水体中采用亚硝酸盐富集方法分离出一株巨大芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌，2株菌株对亚硝酸盐具有良好降解能力。
为了筛选能高效降解亚硝酸盐、具有硝化与好氧反硝化功能，在水体能快速繁殖、净化水质的具安全性原籍芽孢杆菌，本研究取材于健康鳗鲡肠道，针对芽孢杆菌进行菌株分离，通过亚硝酸盐富集培养、复筛，以及对氨氮、硝酸盐降解能力的测定，来评价筛选所得菌株的硝化与反硝化能力。旨在为其将来应用于水产养殖的生物脱氮，寻求高效、经济的微生态制剂水质改良方法提供理论支持与新产品开发提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1鳗鲡
体重约150g的健康鳗鲡购自福建鳗鲡某养殖场。
1.1.2培养基配方
(1)亚硝酸盐富集培养基[22]：葡萄糖10.0g、KNO22.0g、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa灭菌15min。(2)不同氮源降解能力测定培养基[23]：葡萄糖10.0g、KNO20.15g(KNO30.15g或(NH4)2SO40.25g)、NaCl1.0g、MgSO4·7H2O1.0g、K2HPO41.0g、水1L，pH7.2~7.4，1×105Pa灭菌15min。
1.2试验方法
1.2.1菌株富集培养及纯化
参考黄薇[24]与熊焰[20]等研究方法并改进。取健康的鳗鲡解剖，无菌取其肠道，纵向剪开肠道，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲洗肠道内部数次，去除肠道中粪便污水等内容物;用无菌剪刀将清洗的肠道剪碎，加入少量无菌生理盐水震荡混匀，得到菌液原液。将菌液原液按10%比例接入亚硝酸盐富集培养基中，装液量100mL/250mL三角瓶，于28℃，120r/min恒温摇床震荡培养，每天加入5%(m/V)的亚硝酸钾溶液2mL，富集培养7d后，80℃水浴10min，10倍梯度稀释，取不同浓度稀释液，涂布于营养琼脂平板，28℃培养，分离、纯化菌株，将纯化好的菌株保存于-80℃超低温冰箱中备用。
1.2.2菌株复筛与亚硝酸盐降解能力测定试验
参考熊焰[20]与高海英[21]等研究方法并改进。将各自纯化好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃、120r/min恒温摇床震荡培养24h，4℃4000r/min离心10min，弃上清液，细菌沉淀用生理盐水清洗3次，收集菌泥，并用无菌生理盐水稀释终浓度为108CFU/mL的菌悬液，备用。按1%(V/V)接种量，将菌悬液接入亚硝酸盐降解能力测定培养基，28℃，120r/min恒温摇床震荡培养，每隔8h取样检测亚硝酸盐含量与OD600nm处吸光度。
采用N-(1-萘基)-胺光法[25]测定培养液中亚硝酸盐含量，空白对照组接入1%(V/V)无菌生理盐水，选择对亚硝酸盐降解率高且效果稳定的菌株作为备选菌。其中亚硝酸盐降解率的计算公式为：亚硝酸盐降解率=(对照组亚硝酸盐浓度-试验组亚硝酸盐浓度)÷对照组亚硝酸盐浓度。
1.2.3菌株鉴定
菌株16SrRNA测序，采用16SrRNA细菌通用引物[26]进行扩增，正向引物为27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。所得序列经过NCBI(美国生物技术信息中心)数据库的BLAST进行在线同源性比对。
2结果与分析
2.1菌株富集培养及纯化
经亚硝酸盐富集培养基培养1周后，稀释涂布分离得到4种菌落形态不一的菌落，通过革兰氏染色与芽孢染色，初步确定为4种芽孢杆菌，分别编号B1、B2、B3与B4。
2.2菌株复筛与亚硝酸盐降解能力
通过对分离得到的4株芽孢杆菌，按1%接种到亚硝酸盐降解能力测定培养基中，培养32h后，各菌株对亚硝酸盐的降解能力结果。以0h亚硝酸盐浓度85.61mg/L作为起始浓度，对4株分离得到的芽孢杆菌进行复筛，评定对亚硝酸盐的降解能力强弱。空白对照组在32h内，其亚硝酸盐含量变化不大，可以当做在这期间无降解。
而4株芽孢杆菌在前8h对亚硝酸盐的降解差异不明显，至16h菌株B1降解水平明显较其他3株菌强(P<0.05)，24h时，菌株B1亚硝酸盐浓度降至0.47mg/L，降解率99.45%，较其他3株菌差异显著(P<0.05);32h时菌株B1、B2、B3与B4对亚硝酸盐的降解率分别为99.87%、84.79%、98.86%与95.48%，菌株B1对亚硝酸盐的降解率与菌株B2差异显著(P<0.05b3b4p>0.05)。此外，4株芽孢杆菌在前16hOD600值都呈快速增长，在32h内，菌株B1与菌株B3，菌株B2与菌株B4的OD600值变化趋势相似。4株菌株的OD600值变化与对亚硝酸盐降解呈正相关，说明菌株的繁殖，伴随着亚硝酸盐的降解。由此，选取菌株B1作为研究目的菌株。
3讨论
3.1菌株富集培养与复筛
由鳗鲡肠道经过亚硝酸盐富集培养7d，于80℃水浴10min，杀死不能形成芽孢的菌体，分离得到的菌株主要为芽孢杆菌，保证了菌株的原籍性，筛选出来的菌株有利于鳗鲡肠道定植，且对水产动物安全性高、适应能力强。本研究分离筛选得到4株芽孢杆菌，通过以10g/L葡萄糖为碳源、亚硝酸钾为唯一氮源的培养基复筛，菌株B1在培养至24h时亚硝酸盐浓度由85.61mg/L降低至0.47mg/L，降解率达99.45%，与另外3株菌株的降解效果差异显著(P<0.05);菌株B1降解亚硝酸盐效果明显优于枯草芽孢杆菌T905[21，31]、肠膜明串珠菌[32]硝化细菌[33]、光合细菌Ⅰ[34]。随着畜牧业“减抗/替抗”，菌株B1为鳗鲡肠道原籍菌，作为益生菌研发，实现健康养殖，具有较大的潜力。
3.2氨氮与硝酸盐降解能力
芽孢杆菌能有效降解养殖水体中氨氮、亚硝酸盐[35，36]，且具备反硝化作用能力[37]，从而达到去除水体中的氮。本研究以10g/L葡萄糖作为碳源，硫酸铵或硝酸钾作为唯一氮源，培养菌株B1，在24h时，氨氮浓度由52.74mg/L降低至18.71mg/L，降解率为64.52%，与郭强等[38]报道的地衣芽孢杆菌相似，而在32h时对氨氮的降解率达89.65%;在24h时，硝酸盐浓度由96.12mg/L降低至1.04mg/L，降解率98.92%，与刘晶 晶等[39]报道的恶臭假单胞菌相似，但明显优于地衣芽孢杆菌[38]、反硝化菌[40]、红球菌[41]等。同时，进一步说明在相同培养条件下菌株B1在好氧条件下反硝化作用高于亚硝化作用。
3.3模拟处理养殖水体当养殖水体中的亚硝态氮
(以氮计)高于0.1mg/L时就会引起养殖动物应激反应，当养殖水体中亚硝酸盐含量高于0.5mg/L时，鱼会出现中毒症状，严重可导致死亡[42]，但是在有些严重污染的养殖水体中，亚硝酸盐含量高达50mg/L以上[43-45]。
本研究试验期间，先行了解鲫鱼对亚硝酸盐的耐受，在5mg/L亚硝酸盐浓度的水体，鲫鱼外观健康、可以存活。鱼体亚硝酸盐中毒往往呈现急性或亚急性过程，试验浓度远高于0.5mg/L，是否达到鲫鱼中毒剂量，以及鱼体中毒后器官受损等有待进一步探讨。本文动态模拟处理养殖水体中的亚硝酸盐，以5.15mg/L为起始浓度，当处理3d时亚硝酸盐浓度降低至0.41mg/L，降解率达92.04%，低于养殖水体亚硝酸盐鱼体中毒含量。
4d时亚硝酸盐浓度降低至0.12mg/L，降解率达97.67%，基本为养殖水体亚硝酸盐鱼体应激含量，优于同等条件下巨大芽孢杆菌处理4d后亚硝酸盐降低至0.235mg/L;5d亚硝酸盐浓度降低至0.09mg/L，达到养殖水体标准。然而，在复筛试验中，菌株B1在24h对亚硝酸盐的降解率为99.45%，这可能是复筛培养基含有葡萄糖等营养物质，更有利于菌株的繁殖，提高了对亚硝酸盐的降解效果。结果表明，在益生菌处理养殖水体亚硝酸盐时，适当补充葡萄糖等碳源可以提高降解效率。
4结论
本研究从鳗鲡肠道中筛选得到4株芽孢杆菌，经16SrRNA测序与生理生化试验鉴定菌株B1为地衣芽孢杆菌。菌株B1能以氨氮、亚硝酸盐或硝酸盐作为唯一氮源，在24h对亚硝酸盐的降解率达99.45%，氨氮降解率达64.52%与硝酸盐降解率达98.92%。模拟处理养殖水体试验，4d菌株B1对亚硝酸盐的降解由5.15mg/L降低至0.12mg/L，降解率达97.67%，且对水产动物安全、无致病和毒副作用。
综上所述，本研究筛选的菌株B1在好氧培养的条件下具有高效的硝化与反硝化作用能力，与传统好氧硝化细菌与厌氧反硝化细菌相比具有繁殖速度快、能在有氧条件下完成硝化与反硝化作用的独特优势。本研究对养殖水体生物脱氮理论研究具有一定参考意义，也为研发水质改良微生物制剂奠定基础。
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作者：林松泉1，李忠琴2，乔欣君1，林章秀1，邹文政2
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