抗菌肽在动物养殖中的研究进展

　　摘要：抗菌肽是饲料添加剂中最有潜力的替抗产品之一。利用基因工程菌生产抗菌肽产量高、成本低、耗时短，是实现抗菌肽大规模生产的最佳方案。文章综述几种能够生产抗菌肽的表达系统以及抗菌肽在动物养殖中的应用，旨在为抗菌肽发展的方向提供参考。

　　关键词：抗菌肽;基因工程;饲料添加剂

　　抗菌肽是由生物体产生的能够快速抵抗致病性微生物的天然抗生素，在宿主防御中起着重要作用[1]。抗菌肽可以从不同的生物体中被分离出来，包括动物、植物、细菌和真菌[2-4]。抗菌肽数据库(APD)已经收录3000多种天然抗菌肽[5]。抗菌肽通过改变膜的通透性[6]、抑制代谢[7-8]以及调节免疫反应[9]等途径到达抑菌效果，且不易产生耐药性。

　　在替抗的大环境下，抗菌肽以其独特的优势成为当今最有潜力的饲料添加剂之一。抗菌肽的生产方式可以分为3种：从生物体上分离提纯[10-11]、化学合成[12]和生物合成[13]。上述3种方式均可以获得抗菌肽，但存在着产量低、耗时长、成本高等问题。如果需要进行大规模生产，利用基因工程进行生物合成是较好的选择。一些细菌和真菌均可以作为生产抗菌肽的宿主菌，文章对几种能够生产抗菌肽的表达系统以及抗菌肽在动物养殖中的应用进行综述。

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　　1原核表达系统

　　1.1大肠杆菌表达抗菌肽大肠杆菌是常见的原核表达系统，其遗传背景清晰、繁殖迅速，能够高效稳定地表达外源基因，产生有生物活性的蛋白产物。目前，有很多抗菌肽在大肠杆菌中成功表达的研究[14]。抗菌肽的分子量小，不易分离和提纯，可将同一种抗菌肽基因串联表达，增加分子量;或者将抗菌肽与其他蛋白串联起来[15-16]。但是，利用大肠杆菌表达抗菌肽也存在一定的弊端。抗菌肽对大肠杆菌存在一定的伤害，可能会导致细胞死亡;大肠杆菌细胞内的酶会降解抗菌肽;在抗菌肽的分泌过程中可能会有包涵体的产生等。

　　1.2枯草芽孢杆菌表达抗菌肽枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，是一种用于大规模生产重组蛋白的替代表达系统。枯草芽孢杆菌表达系统优势为该菌耐热、不产内毒素和外毒素、有很好的发酵基础[17]。枯草芽孢杆菌是一种绿色的饲料添加剂，具有改善肠道功能，提高动物免疫力的优点[18]。Li等[19]成功将一种从蜂蜜中提取出的抗菌肽abaecin在枯草杆菌中表达，并且达到抑菌效果，说明枯草杆菌表达系统可以作为生产抗菌肽的一种强有力的工具。但与大肠杆菌表达系统相比，枯草芽孢杆菌的表达载体、质粒以及产物表达过程均存在着不稳定性，这些问题还需亟待解决[17]。

　　1.3地衣芽孢杆菌表达抗菌肽地衣芽孢杆菌能够促进肠道有益菌的生长，多用在水产养殖，对弧菌的抑制作用较佳[20]。通过基因工程改造地衣芽孢杆菌在产酶上已经得到一些成果，但是通过表达外源基因生产抗菌肽的相关报道较少。2009年，有研究人员提出将细菌素基因转入地衣芽孢杆菌中表达[21]。2014年，华中农业大学成功构建出一株高产地衣素的地衣芽孢杆菌，优化培养基后最高产量达2149mg/L(比亲本菌种提高16.8倍)[22]。虽然本身存在着一定优势，但是地衣芽孢杆菌并未成为生产抗菌肽的一种基因工程菌，利用地衣芽孢杆菌还存在一定难度。

　　1.4乳酸菌表达系统

　　乳酸菌可以调节肠道菌群平衡，提高生产性能。乳酸菌的产酸能力强，可以充当饲料中的酸化剂[23]。乳酸菌自身可以分泌出各种抗菌肽来抑制病原菌的生长，最多见的是细菌素。细菌素可以作为防腐剂和抗菌剂在市场上应用，但是不具有广谱抑菌性[24]。开发具有广谱活性的新型细菌素成为关注的重点。研究人员从乳酸菌中分离出几种新型细菌素和非核糖体抗菌肽，以上几种抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑制作用[25]。乳酸菌的研究热点集中在如何从中分离出新型抗菌肽[26-27]，而不是让其表达外源基因。这一点可能是由于相较于其他的表达系统，乳酸菌的遗传背景和生物学信息不够清晰，在分子操作上存在一定的难点。

　　2真核表达系统

　　2.1毕赤酵母表达抗菌肽与原核生物表达系统不同，真核系统对蛋白质有一定的修饰作用，可以避免产生无生物活性的产物。毕赤酵母是优选的真核表达系统，能够使用甲醇作为其唯一的碳源，基因中含有由甲醇诱导的AOX1启动子可以实现基因的高水平表达[28]。与其他的真核表达系统相比，利用毕赤酵母表达外源基因，生产蛋白类物质更容易分泌到细胞外。例如，利用毕赤酵母表达抗菌肽NZX，在5L发酵罐中进行120h的诱导，产物收率可达965mg/L，纯度为92.6%[29]。利用毕赤酵母实现大规模生产的局限性在于毕赤酵母的强启动子AOX1需要利用甲醇诱导，甲醇使得生产安全性大大降低。目前，大多使用不需要进行甲醇诱导的组成型启动子。

　　2.2酿酒酵母表达抗菌肽在饲料中添加酿酒酵母培养物能够起到增加饲料适口性、增大采食量、提高动物的抵抗力的作用。利用酿酒酵母表达抗菌肽的优势在于安全性。目前，通过酿酒酵母表达抗菌肽，并实现大量生产的实例较少，因为酿酒酵母表达系统存在糖基化严重的问题，会导致大量蛋白失活。但是，也有一些研究展现出酿酒酵母表达抗菌肽的潜力，如菌丝霉素[30]、牛乳铁蛋白肽[31]以及一些报道较少的抗菌肽[32]均实现了在酿酒酵母中的成功表达。

　　3抗菌肽在动物养殖中的应用

　　3.1抗菌肽在水产养殖中的应用邱继新等[33]研究发现，日粮中添加100mg/kg蝇蛆抗菌肽，饲喂56d后，鳙鱼饵料系数降低16.56%，成活率提高10%，表明添加蝇蛆抗菌肽可以有效促进鳙鱼生长，降低养殖成本。董晓庆等[34]研究发现，添加200mg/kg抗菌肽时，鲤鱼生长状态良好，有利于蛋白质、钙、磷的积累。使用抗菌肽浸泡虹鳟苗种，通过对相关免疫酶以及体表细菌的观察，发现抗菌肽浸泡能够提高虹鳟苗种的免疫力，减少体表细菌滋生，大大提高幼鱼成活率[35]。

　　3.2抗菌肽在反刍动物养殖中的应用抗菌肽可以作为幼龄山羊的饲料添加剂，添加抗菌肽可以提高瘤胃木聚糖酶、果胶酶和脂肪酶的活性;也可以提高乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度，有助于山羊的生长[36-37]。杨颜铱[38]研究表明，复合抗菌肽“态康利保”可以增强川中黑山羊细胞、体液免疫应答。陈芸等[39]研究表明，添加复合抗菌肽可以降低山羊瘤胃变形菌门和螺旋菌门的相对含量，提高部分降解纤维菌属的含量，并且瘤胃菌群结构多样性不受复合抗菌肽的影响。柳涵等[40]研究发现，抗菌肽可以明显提高奶牛产奶量，对奶牛隐性乳房炎也有一定的防治效果[41]。

　　3.3抗菌肽在家禽养殖中的应用张磊[42]研究表明，抗菌肽能够提高海兰褐蛋鸡产蛋后期的产蛋率，改善鸡蛋的营养成分。益生菌与抗菌肽的复合优于单独使用[43]。王建[44]研究发现，将抗菌肽Api-PR19添加到肉鸡日粮中，肉鸡肠绒毛组织结构得到改善，肠道有害菌的数量减少，肉鸡的生长性能得到改善。张江等[45]研究发现，添加微生态制剂和抗菌肽复合物可以提高樱桃谷鸭的成活率。

　　3.4抗菌肽在猪养殖中的应用梁秀丽等[46]研究发现，抗菌肽B-13可以改善初生仔猪小肠形态，提升盲肠微生物菌群多样性和丰富度。刘又铭等[47]研究表明，抗菌肽对由脂多糖引起的仔猪消化性能降低有明显的改善作用。袁威等[48]研究表明，抗菌肽在提高断奶仔猪生长性能和其免疫力等方面具有良好的效果。黄荣春[49]研究表明，抗菌肽可以显著增加仔猪出生重、平均产活仔数、平均产健仔数和健仔率。

　　4展望

　　利用原核表达系统生产抗菌肽的优势在于繁殖快、培养周期短、表达抗菌肽易于分离纯化;与真核表达系统相比的劣势在于无法进行蛋白质的进一步修饰以及难以抵抗抗菌肽对自身的伤害。较为常用表达系统，如大肠杆菌和毕赤酵母，两者均已经具备成熟的操作手段，并且均已经取得了不错的成果。枯草芽孢杆菌、乳酸菌以及酿酒酵母由于其本身的安全性，同样具有发展潜力。抗菌肽作为饲料添加剂，在改善动物肠道菌群、维持肠道健康、提升动物免疫力等方面有积极作用。但单一的抗菌肽产品并不能完全代替抗生素，还需要和其他的替抗产品复配。对于不同的动物来说，抗菌肽的添加量需要通过进一步的试验来确定。

　　参考文献

　　[1]孙得发，肖发沂，都振玉，等.抗菌肽在畜牧养殖中的应用与研究进展[J].现代畜牧兽医，2020(6)：59-64.

　　[2]GuangshunW.Database-guideddiscoveryofpotentpeptidestocombatHIV-1orsuperbugs[J].Pharmaceuticals,2013,6(6):728-758.

　　[3]DubosRJ.StudiesonabactericidalagentextractedfromasoilBacillus:I.Preparationoftheagent.Itsactivityinvitro[J].Exp.Med.,1939,70:1-10.

　　[4]SteinerH,HultmarkD,EngströmA,etal.Sequenceandspecificityoftwoantibacterialproteinsinvolvedininsectimmunity[J].Nature,1981,292:246-248.

　　[5]WangZ,WangG.APD:Theantimicrobialpeptidedatabase[J].NucleicAcidsRes.,2004,32:590-592.

　　[6]Barreto-SantamaríaA,RiveraZJ,GarcíaJE,etal.ShorterantibacterialpeptidehavinghighselectivityforE.colimembranesandlowpotentialforinducingresistance[J].Microorganisms,2020,8(6):867.

　　[7]Flórez-CastilloJM,Rondón-VillarealP,Ropero-VegaJL,etal.IbM6antimicrobialpeptide:AntibacterialactivityagainstclinicalisolatesofEscherichiacoliandmoleculardocking[J].Antibiotics,2020,9(2):79.

　　[8]LeeB,HwangJS,LeeDG.AntibacterialactionoflactoferricinBlikepeptideagainstEscherichiacoli:Reactiveoxygenspecies-inducedapoptosis-likedeath[J].JournalofAppliedMicrobiology,2020,129(2):287-295.

　　作者：张雨陈鹏

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