低分子量褐藻多糖的制备及其活性分析

所属分类：农业论文阅读次时间：2021-09-09 10:17

本文摘要：摘要：利用抗坏血酸协同过氧化氢法降解褐藻多糖，以DPPH自由基清除率为指标，通过工艺优化得到最佳降解条件，然后用超滤技术将降解产物进行分级，获得不同分子量组分，并分析其DPPH自由基清除率、保湿效果，酪氨酸酶抑制率等活性。正交试验结果表明，最佳降

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　　摘要：利用抗坏血酸协同过氧化氢法降解褐藻多糖，以DPPH自由基清除率为指标，通过工艺优化得到最佳降解条件，然后用超滤技术将降解产物进行分级，获得不同分子量组分，并分析其DPPH自由基清除率、保湿效果，酪氨酸酶抑制率等活性。正交试验结果表明，最佳降解条件为VC浓度20mmol/L、降解温度45℃、降解时间3h，在此条件下获得的降解产物的DPPH自由基清除率达到61.23%，降解产物得率为73.16%。电泳结果表明，降解后的褐藻多糖的条带明显出现在低分子量区。利用超滤系统将降解产物分级为5kDa、10kDa、1030kDa、>30kD四个不同分子量段的组分，研究发现各分子量段之间的活性存在显著差异(<0.05)，尤其5kDa组分(其主要成分为2.140×10Da，占比29.6%)的活性最好，其DPPH自由基清除率为59.27%，60后保湿率为75.75%，酪氨酸酶抑制率为65.28%。与褐藻多糖相比，其糖醛酸含量稍有下降。本研究结果可为褐藻多糖在功能性食品等领域的应用提供理论依据。

　　关键词：低分子量褐藻多糖，制备，DPPH自由基清除率，保湿效果，酪氨酸酶抑制率

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　　褐藻多糖，又名褐藻多糖硫酸酯、褐藻胶，主要来源于海带、巨藻、泡叶藻、墨角藻等海藻，集中于褐藻植物细胞壁中，是一种含有硫酸基团的高分子量的杂多糖，具有抗氧化、降尿酸、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等生理功能[13]，在功能性食品、果蔬保鲜等方面具有较大应用潜力。然而，由于天然褐藻多糖存在着分子量大、黏度高，渗透性差，不利于吸收等问题，其应用受到很大限制。

　　研究表明，通过一定方式降解多糖，获得低分子量多糖，能够提高多糖的生物活性和生物利用率[4,5]。Zhao等[6]以海带为原料制备的低分子量岩藻多糖对超氧自由基、羟自由基等有较强的体外清除作用。Xue等[7]研究表明低分子量的硫酸多糖对低密度脂蛋白的氧化作用强于粗岩藻糖。任立士等研究发现通过利用自由基降解法制备的海藻寡糖，具有良好的清除自由基的能力[8]。因此，通过适当方法降低褐藻多糖分子量，是发挥其生理活性的重要途径。

　　目前，低分子量褐藻多糖的制备方法可分为物理法、化学法、生物酶解法[7]。生物酶解法条件温和且分子量较易控制，但酶制剂价格昂贵且不易获得[9]。硫酸基团对褐藻多糖活性的发挥起到很重要的作用，ang、Mohsin等研究发现，低分子量褐藻多糖自由基清除能力、抗凝血活性与硫酸根含量成正相关1011。Anastyuk等2]研究发现，由于硫酸酯基及α，岩藻糖苷键的存在，低分子量褐藻糖对人体恶性黑色素瘤细胞系SKMEL28表现出了较好的抑制性。Shao等13研究表明，体外抗癌活性与褐藻多糖分子中的硫酸根含量有关。

　　同时，硫酸化的褐藻多糖被报道具有抑制单纯形疱疹病毒(HSV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的能力1415，甚至被推断具有抗新冠病毒(coronavirusdisease2019COVID19)的能力16。因此在选择方法的时候应着重注重对硫酸基团的保护，但化学方法对硫酸基团的破坏较为严重，不适合应用。作者前期实验表明，利用自由基法可有效降解褐藻多糖，同时不会过度破坏硫酸基团。因此，本实验利用抗坏血酸辅助过氧化氢法对褐藻多糖进行降解，以DPPH自由基清除率为指标进行降解条件优化。利用超滤系统对降解的多糖进行分级，对比不同分子量段降解多糖的DPPH自由基清除率、保湿性以及酪氨酸酶抑制活性，分析其分子量及化学组成，以期为褐藻多糖在食品等领域的应用提供依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器褐藻多糖：山东洁晶集团股份有限公司;琼脂糖凝胶：青岛源叶生物技术公司;透明质酸：广州高良生物科技有限公司;DPPH：北京索莱宝科技有限公司;过氧化氢、抗坏血酸等均为市售国产分析纯。真空冷冻干燥机：德国CHREIST公司;DU800型紫外可见分光光度计：美国贝克曼公司;SHAB水浴恒温振荡器：常州国华电器有限公司;高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司;DYY6C型电泳仪：北京市六一仪器厂;超滤膜分离系统：美国赛默飞公司;十八角度激光光谱散射仪：美国Wyatt公司;DGU20A5R高效液相色谱仪：日本岛津公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1褐藻多糖的降解

　　配制1%的褐藻多糖溶液，加入一定体积的30%过氧化氢和抗坏血酸，在一定温度下降解一段时间后，用0.01mol/L氢氧化钠(NaOH)调节溶液pH至中性，采用200D透析袋，蒸馏水透析，冻干后得降解产物。

　　1.2.2褐藻多糖降解单因素及正交试验

　　以褐藻多糖降解产物的DPPH自由基清除率为指标，使用过氧化氢结合抗坏血酸的方法降解褐藻多糖[17,。配制1%的褐藻多糖溶液，以实验条件VC浓度15mmol/L(向100mL褐藻多糖溶液中添加153µL30%过氧化氢溶液和0.26gVC)、降解温度℃、降解时间为固定因素水平，按照表替换相应因素水平进行单因素实验。根据单因素试验结果，设计因素水平正交试验，以褐藻多糖降解产物DPPH自由基清除率为指标确定最佳降解条件。

　　2结果与分析

　　2.1单因素试验结果分析

　　随2–VC用量增加，清除率从40.2%升至56.1%，2–VC用量为20mmol/L之后清除率开始下降。这可能是由于含量过高时，自由基氧化反应剧烈，产物脱硫现象和脱羧反应较为严重2425，因此，2–VC的最适用量为20mmol/L。一般来说，温度的升高会导致反应速率的增加，更高的温度意味着更高的分子平均动能和单位时间内更多的碰撞26。

　　随着温度的升高，清除率快速升高，当温度到45℃时，清除率达到最大为54.1%，因此，适当提高反应温度有利于活性增强。当温度高于45℃时，清除率开始下降，原因可能是当温度过高时，VC活性降低并且部分分解，导致降解多糖的能力降低，导致清除率下降27，因此最适温度为45℃。如图所示，随着反应时间的延长，DPPH自由基清除率呈现先上升后平缓趋势，当降解时间为3h时，清除率达到最大值为48.9%。原因可能随着时间的延长，多糖分子量不再减小或者分子量减小趋势变缓,29]，使DPPH自由基清除率趋于平缓，因此，最适降解时间为3h。

　　2.2正交试验结果分析

　　在单因素试验的基础上，选取2VC浓度、降解温度和降解时间三个因素，每个因素各取三个水平，各因素对抗氧化活性的影响程度依次为2VC浓度>降解时间>降解温度，2–VC的用量对褐藻多糖降解后DPPH清除率影响最为大，最佳组合是，即2VC浓度为20mmol/L、降解温度45℃、降解时间。随后进行了最佳组合验证实验，所得降解产物的DPPH自由基清除率为61.23±0.55%，高于正交试验中的最高值，证明正交实验结果有效，此条件下降解产物得率为73.16%。

　　3结论

　　本研究以DPPH自由基清除率为评价指标，建立了以2VC自由基法降解褐藻多糖的方法，正交试验优化得到最佳降解条件为2VC浓度为20mmol/L、降解温度45℃以及降解时间3h，最佳条件下降解产物得率为73.16%，DPPH自由基清除率为61.23%。凝胶电泳结果表明，降解后的褐藻多糖的条带明显出现在低分子量区，说明该降解法稳定并有效。

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　　通过超滤系统将此产物降解分为5kDa、5kDa10kDa、10kDa30kDa、30kDa四段，DPPH自由基清除率、保湿性、以及酪氨酸酶抑制活性研究表明，<5kDa分子量段的组分的活性显著高于其它组分(<0.5)。进一步测定了<5kDa分子量段组分的单糖组成与分子量分布，结果表明，与多糖相比，该组分的岩藻糖含量略高，葡萄糖醛酸含量相对减少;经测定，该组分主要含有五个组分，其中2.140×10Da含量最高，达到29.6%，其次是4.126×10Da组分，占比为24.1%。研究结果可为低分子量褐藻多糖的在功能性食品等领域的应用提供数据基础，下一步可以在低分子量褐藻多糖的构效关系方面开展更深入的研究。

　　参考文献

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　　[5]韩莎莎,黄臻颖,沈照鹏,等.酶法降解坛紫菜多糖及其产物分析[J].食品科学,2015,36(21):145149.HanSS,HuangZY,ShenZP,etal.EnzymaticDegradationofPolysaccharidefromPorphyrahaitanensisandAnalysisofItsProducts[J].FoodScience,2015,36(21):145149.

　　作者：阙斐，陶文靖,冯文婕