小菜蛾Toll6基因的克隆及功能分析

　　摘要：为探究Toll基因在小菜蛾先天免疫中的功能，对克隆鉴定的Toll基因序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR检测Toll基因的时空表达模式及微生物侵染响应模式，体外验证其在微生物结合、病原相关分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)结合、细菌凝集等方面的功能。结果表明：Toll基因全长2313bp，编码770个氨基酸，预测Toll6蛋白具有富含亮氨酸重复序列的LRR胞外区、跨膜区和TIR胞内等典型Toll受体家族特征;Toll基因在不同发育阶段及不同组织中均有表达，其中成虫期表达量最高，龄幼虫次之，在龄幼虫中肠表达量最高;此外，苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾龄幼虫6h后，Toll基因表达被显著抑制，而黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6侵染小菜蛾龄幼虫12h时，Toll基因表达被显著上调，18h后Toll基因表达被显著抑制;蛋白体外功能验证表明Toll蛋白不仅与细菌和真菌具有直接结合能力，还能与肽聚糖和脂多糖结合，但不具备细菌凝集功能。表明Toll蛋白可能作为模式识别受体直接识别并结合入侵病原微生物表面的PAMP，启动小菜蛾对入侵病原微生物的先天免疫防御，且对不同微生物可能具有不同的响应机制。

　　关键词：小菜蛾;Toll受体;先天免疫;模式识别受体;基因表达;病原菌侵染

　　免疫系统对昆虫适应细菌、真菌、病毒以及真核寄生虫等的复杂环境至关重要(Zhangetal，2019)，是昆虫生存和繁衍的前提与保障。昆虫不具备高等脊椎动物的获得性免疫系统，先天免疫系统成为其抵御病原微生物感染的重要防御体系。Toll通路是与先天免疫有关的主要信号通路之一，其响应真菌和革兰氏阳性菌的感染，在免疫防御中具有重要作用(Wangetal，2018)。

　　昆虫Toll受体是Toll通路中的关键效应因子，能够识别胞外特异性配体并引发胞内信号通路的级联反应，在维持Toll信号通路的正常免疫应答及抵抗入侵病原微生物的过程中扮演着重要角色(廖文丽等，2017)。阐明Toll受体的功能是理解昆虫Toll信号通路以及相关免疫防御机制的基础。Toll受体最早在果蝇中发现，并被鉴定为一种跨膜受体，不仅参与机体发育，而且参与对真菌和革兰氏阳性细菌的免疫应答(Nicolasetal，1996)。

　　人体内鉴定得到10个Toll样受体(olllikereceptor，TLR)，其作为典型的模式识别受体(patternrecognitionreceptor，PRR)，与特定病原相关分子模式(athogenassociatedmolecularpattern，PAMP)直接结合进而诱导相应的免疫防御响应(Takeda&Akira，2005)。在甲壳类动物中，Toll受体发挥免疫功能的作用方式因物种不同而异，如日本囊对虾MarsupenaeusjaponicasToll受体与哺乳动物相似，作为PRR激活Toll信号通路(Sunetal，2017);日本沼虾MacrobrachiumnipponenseToll受体既可作为PRR识别外源入侵物，又可作为细胞因子受体与活化的内源性配体结合(Panetal，201)。

　　在昆虫中，Toll受体不仅可以作为跨膜受体与活化的神经生长因子同源物Spätzle配体结合，激活胞内Toll信号通路，调控抗菌肽的表达(Nieetal，2018)，而且昆虫Toll受体还能直接作为PRR与特定的PAMP结合，发挥免疫学功能(Nakamotoetal，2012;廖文丽等，2017)。

　　昆虫由于其物种多样性、生存环境的多态性，其免疫功能也会发生物种分化，具备种属的特异性，因此从昆虫Toll受体发挥免疫功能作用方式探究其诱导的免疫防御反应对于阐明昆虫Toll受体功能及其介导的免疫防御机制具有重要意义。小菜蛾Plutellaxylostella是世界性害虫之一，对十字花科蔬菜具有极强的破坏性，其抗药性高，已对包括Bt在内的所有用于防治的杀虫剂均产生了抗性(徐艳聆等，2006;Furlongetal.，2013)。生物农药是未来农药产业发展的趋势，但小菜蛾的免疫防御反应能够降低或者延缓微生物农药的作用效率(彭露等，2015)。

　　因此，从小菜蛾抵御入侵病原微生物的免疫防御系统——Toll通路入手，探究Toll受体的免疫应答机制对于生物农药的改良与新型生物农药的开发具有重要意义。Xiaetal(2015)通过比较基因组学从小菜蛾基因组中鉴定到个Toll受体基因;Linetal(2018)研究表明小菜蛾Toll和Toll10基因参与细菌和真菌的免疫应答，但Toll基因在先天免疫系统中所扮演的角色及其是否与病原体直接结合未见报道。因此，本研究通过克隆表达小菜蛾Toll基因，研究其表达模式和免疫防御响应，并在体外验证其在PAMP结合、微生物结合及细菌凝集等方面的功能，以期为后续深入探究Toll受体在小菜蛾先天免疫反应中的功能奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　供试昆虫和菌种：供试小菜蛾为以人工饲料饲养的小菜蛾Bt敏感品系SLss，由中国科学院动物研究所提供，于福建农林大学应用生态研究所人工气候室内饲养，人工气候室温度(25±2)°C、相对湿度70%~80%、光照周期为16L：8D，幼虫用人工饲料饲喂，成虫用10%蜂蜜水饲喂。供试大肠杆菌Escherichiacoli菌株BL21、大肠杆菌感受态细胞DH5α、含pGTf2质粒的大肠杆菌感受态BL21(DE3)、毕赤酵母Pichiapastoris、苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis菌株Bt8010、金黄葡萄球菌Staphylococcusaureus、肠杆菌Enterobactersp.菌株EbPXG5和黏质沙雷氏菌Serratiamarcescens菌株SmPXG6，均由福建农林大学应用生态研究所保存。

　　培养基：LB(LuriaBertani)液体培养基成分为5g酵母抽提物、10g蛋白胨、10g氯化钠，去离子水定容至1L;LB固体培养基为LB液体培养基中添加琼脂粉15g;酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD)成分为10g酵母抽提物、20g蛋白胨、20g葡萄糖，去离子水定容至1L。

　　试剂：Trizol，美国Invitrogen公司;胶回收试剂盒，瑞士Omega公司;PhantaMax高保真酶(P505)、2×PhantaMaxuffer等PCR试剂，南京诺唯赞生物科技股份有限公司;TOPOBlunt平末端克隆试剂盒、牛血清蛋白(bovineserumalbumin，BSA)、兔抗Histag多克隆抗体，上海翊圣生物科技有限公司;RNA提取试剂盒、GoTaq®qPCRMasterMix、CXR参比染料等荧光定量试剂，美国Promega公司;FastKing一步法反转录试剂盒、质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司;pET28b质粒，重庆优宝生物技术股份有限公司;NotⅠ、T4DNALigase，日本TAKARA公司;NcoI，美国NEB公司;Western半干法转膜液，上海碧云天生物技术有限公司;HRP羊抗兔IgG，武汉博士德生物工程有限公司;4%多聚甲醛、TMB单组分显色液、终止液、异硫氰酸荧光素酯FITC，北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

　　仪器：GHP9080型隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司;JD801型凝胶成像仪，江苏省捷达科技发展有限公司;DYY10C型电泳仪，北京六一仪器厂;5331型PCR仪、5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司;T6型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司;SP8型激光共聚焦显微镜，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司;Synergyh1型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;NanoDrop2000型微量测定仪，赛默飞世尔科技公司;OLYMPUSIX71倒置相差荧光显微镜，奥林巴斯公司;96孔板，美国BioRad公司。

　　1.2方法

　　1.2.1小菜蛾Toll6基因的克隆

　　采用Trizol法提取5头小菜蛾3龄幼虫总RNA，采用微量测定仪检测RNA浓度与质量，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。参照FastKing一步法反转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为PCR扩增模板。根据小菜蛾基因组数据库DMBDB(ftp://iae.fafu.edu.cn/pub)提供的小菜蛾Toll6基因序列(登录号为PX004048)，利用SnapeGene3.2.1软件设计特异性引物Px004048F(5'ATGCTGCTAATACTACTTATGC3')/Px004048R(5'TTATGCCAAAGACTCCGTTTC3')，引物均委托福州尚亚生物技术有限公司合成，以此为上下游引物。50μLPCR反应体系：2×PhantaMaxuffer25μL、cDNA模板2μ、10μmol/L上下游引物各2μL、dNTPMix1μL、PhantaMax高保真酶1μL、无核酸酶水17μL。

　　PCR反应程序：95℃预变性3.0min;95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，35个循环;72℃延伸5.0min。将PCR产物电泳后切胶回收，连接PESI载体后转化到感受态细胞DH5α上，筛选含有pESIToll6质粒的阳性菌株送至上海铂尚生物技术有限公司测序。利用SnapGene3.2.1软件将所测序列与DMBDB数据库中小菜蛾Toll6序列进行BLAST比对，将序列结果正确的菌液按1:1体积比与50%甘油混合，标记后于80℃冰箱保存备用。

　　1.2.2小菜蛾Toll6基因的生物信息学分析

　　利用ESPript3.0在线软件，分析保守结构域。利用ExpasyTranslate在线软件翻译小菜蛾Toll6基因的核酸序列，获得相应氨基酸序列。利用SingnalP5.0信号肽预测工具预测信号肽。利用SMART在线软件分析小菜蛾Toll6蛋白的结构域。使用ExPASyProtParam在线软件预测小菜蛾Toll6蛋白的分子量和等电点。利用MEGA10.0.5软件，采用邻接法构建小菜蛾Toll6蛋白氨基酸序列的系统发育树，使用1000次重复的自举抽样法评估系统发育树分支的可靠性(Kumaretal，201)。

　　1.2.3小菜蛾各发育阶段及各组织中Toll6的表达分析

　　小菜蛾各发育阶段及各组织的样本采集：分别收集小菜蛾卵200粒、1龄幼虫50头、2龄幼虫30头、3龄幼虫10头，4龄幼虫、蛹和成虫各2头，于80℃冰箱保存备用，每个发育阶段重复3次。

　　分别收集30头小菜蛾4龄幼虫的中肠、脂肪体、血淋巴，于80℃冰箱保存备用，每个组织重复3次。实时荧光定量PCR检测：按照RNA提取试剂盒说明书提取小菜蛾不同发育阶段和不同组织样本的RNA，按照FastKing一步法反转录试剂盒说明书合成cDNA，以此为实时荧光定量PCR模板。利用Oligo7软件在线设计特异性引物Toll6qPCRF(5'CTGGCGGATTACAGGCAAATC3')/Toll6qPCRR(5'GAGCTAGACACACCATGAGAACAAC3')，以小菜蛾核糖体蛋白基因PxylRPL32(GenBank登录号为AB180441)为内参基因，并以PxylRPL32F(5'CAATCAGGCCAATTTACCGC3')/PxylRPL32R(5'CTGGGTTTACGCCAGTTACG3')(Bautistaetal.，2009)为内参引物进行实时荧光定量PCR。

　　20μL实时荧光定量PCR反应体系：cDNA模板1μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、无核酸酶水7.05μL、GoTaq®qPCRMasterMix10μL、CXR参比染料0.15μL。反应程序：95℃预变性10min;95℃变性15s，60℃退火30s，溶解温度60℃，40个循环。每个样品3个生物学重复，采用2−ΔΔCT方法进行相对表达量分析(Livak&Schmittgen，2001)。

　　1.2.4小菜蛾Toll6对不同微生物侵染的响应试验无菌饲料的配制：称取麦胚粉7.5g、酵母粉4.0g、蔗糖2.0g、萝卜籽0.6g、琼脂1.2g，倒入250mL锥形瓶中，加入200µL菜籽油、1滴亚油酸、50mLddH2O，玻璃棒搅拌均匀，115℃灭菌30min。待冷却至60℃，置于超净工作台内加入2mL无菌维生素混合液，摇晃均匀后，倒入90mm培养皿内，晾干后置于4℃冰箱中保存备用。

　　带菌饲料的配制：将无菌饲料装到250mL的锥形瓶中，置于微波炉中融化，待冷却至60℃时加入2mL无菌维生素混合液，振荡混匀，待温度冷却至瓶身触手不烫时，分别加入终浓度为5.3×108菌体/mL的苏云金芽胞杆菌菌株Bt8010和黏质沙雷氏菌菌株SmPXG6菌液，振荡均匀后，倒入90mm培养皿内，晾干后置于4℃冰箱中保存备用，以加入同体积无菌水的无菌饲料为对照(CK)。

　　将2种带菌饲料和CK切成1cm×1cm×1cm的饲料块。随机选取生长一致的小菜蛾3龄末幼虫50头，置于养虫盒内，饥饿4h后分别用3种饲料块饲喂，处理0、6、12、18、24h后，每个处理随机选择小菜蛾4龄幼虫3头，液氮处理后于80℃冰箱保存备用。利用实时荧光定量PCR检测不同样品中Toll6基因的相对表达量，反应体系及程序同1.2.3，每个处理重复3次。

　　此外，处理0h与12h时，每个处理随机选取30头小菜蛾4龄幼虫，进行中肠解剖，将其置于组织RNA稳定保存液中，于80℃冰箱中保存备用，利用实时荧光定量PCR检测不同样品中Toll6基因的表达，荧光定量PCR反应体系及程序同1.2.3，每个处理重复3次。

　　1.2.5小菜蛾Toll6重组蛋白的表达和纯化重组表达载体的构建：在得到的小菜蛾Toll6基因开放阅读框(Openreadingframe，ORF)的基础上，设计1对带有NcoⅠ和NotⅠ酶切位点的小菜蛾Toll6基因成熟肽特异性引物Toll6ORFF(5'CATGCCATGGGTAGTGGGGGTTTACACC3')/Toll6ORFR(5'ATTTGCGGCCGCTGCCAAAGACTC3')。

　　将扩增片段连接到pET28b载体上，重组质粒pET28bToll6经热激转化转入到含pGTf2质粒的大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，构建重组工程菌，筛选阳性克隆的菌液PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司测序，利用SnapGene3.2.1软件将所测序列与小菜蛾Toll6基因的克隆序列进行BLAST比对，对序列结果正确的菌液进行诱导表达。

　　菌液PCR反应体系：菌液1μL、10μmol/LT7通用上下游引物各1μL、2×HieffPCRMasterMix12.5μL、无核酸酶水9.5μL。PCR反应程序：95℃预变性3.0min;95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，20个循环;72℃延伸5.0min。

　　1.3数据分析

　　使用SPSS21软件对试验数据进行统计分析，采用LSD法对小菜蛾不同发育时期及不同组织中PxToll-6基因的表达量及Toll6蛋白的结合能力进行差异显著性检验，采用独立样本t检验法对不同处理之间小菜蛾Toll-6基因的表达量进行差异显著性检验。

　　2结果与分析

　　2.1小菜蛾

　　Toll-6基因的克隆及生物信息学分析通过PCR克隆得到小菜蛾的Toll-6基因序列(GenBank登录号为MW446554)，全长2313bp，编码770个氨基酸，预测Toll6蛋白的等电点和分子量分别为6.04kD和87.5kD。多序列比对和SMART软件分析表明该氨基序列包含1个由1~16位氨基酸组成的信号肽、1个跨膜结构域和1个Toll与白介素1受体同源(Toll/interleukin1receptorhomologous，TIR)结构域、3个富含亮氨酸重复序列(leucinerichrepeats，LRR)结构域以及1个典型富含亮氨酸重复序列亚家族(leucinerichrepeats,typicalsubfamily，LRRTYP)结构域，属于保守型序列。系统发育分析显示，鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫的Toll受体在进化树上形成3个独立的分支，其中鳞翅目与双翅目昆虫的Toll受体亲缘关系较近，在鳞翅目昆虫中小菜蛾Toll6与大债避蛾EumetajaponicaToll6的亲缘关系最近。

　　3讨论

　　本研究从小菜蛾基因组中成功克隆到Toll-6基因，其编码的氨基酸序列具有典型Toll受体家族特征——LRR胞外区、跨膜区和TIR胞内区，与果蝇、家蚕Bombyxmori、意大利蜜蜂Apismellifera等昆虫的Toll受体有相似的结构特点(Hoffmann&Reichhart，2002;Sunetal.，2017;Aronstein&Saldivar，2005;Chengetal.，2008)。家蚕Toll受体的胞外LRR结构域负责Toll受体与多肽的高亲和力结合(Chengetal.，2008)，含有LRR结构域的CD14蛋白通过直接与细菌脂多糖结合参与巨噬细胞对入侵细菌的先天免疫反应(Hailmanetal.，1994;Kobe&Deisenhofer，1995)。

　　此外，在许多与发育和先天免疫反应相关的基因中均存在TIR结构域，它可以与下游接头分子上相应区域相互作用，进而激活通路中下游元件发挥作用(孙佩璐等，2019)。因此推测小菜蛾Toll6蛋白胞外LRR结构域可能与细菌的脂多糖和肽聚糖等结合，而其胞内TIR结构域则通过与下游接头分子互作参与小菜蛾的先天免疫反应。此外，小菜蛾Toll6蛋白含有一个1~16位氨基酸组成的信号肽，推测其可能属于分泌蛋白。系统发育分析表明小菜蛾Toll6蛋白与大债避蛾EumetajaponicaToll6蛋白亲缘关系最近，推测它们可能在先天免疫反应中发挥着类似的功能，鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫的Toll受体在进化树上形成3个独立的分支，表明Toll受体在不同目中具有保守性。

　　本研究结果显示，Toll-6基因在小菜蛾成虫期表达量最高，究其原因可能是成虫活动环境复杂，接触病原物的机会更多，小菜蛾通过提高其体内Toll-6基因表达水平来应对病原物的入侵。此外，Toll-6基因在小菜蛾4龄幼虫中的表达量仅次于成虫期，其原因可能是处于暴食期的4龄幼虫在大量摄取食物的同时接触各种病原物的概率大大增加，小菜蛾同样需要较高表达Toll-6基因来应对病原物的入侵。

　　中肠是小菜蛾重要的免疫器官，其内存在Toll、免疫缺陷(immunedeficiency，IMD)和Janus激酶信号转导和转录激活因子(Januskinasesignaltransducerandactivatoroftranscription，JAKSTAT)等复杂多样的免疫通路，参与小菜蛾先天免疫反应(Linetal.，2018)。本研究结果显示Toll-6基因在小菜蛾4龄幼虫中肠中表达量最高，表明Toll-6基因很可能作为Toll信号通路中的一员参与调节小菜蛾中肠先天免疫应答。Lunaetal(2002)研究结果表明Toll-9基因在冈比亚按蚊Anophelesgambiae成虫中肠中高表达，其可能参与抵抗入侵病原物的先天免疫反应，与本研究结果一致。本研究发现小菜蛾Toll-6基因既可以响应革兰氏阴性细菌又可以响应革兰氏阳性细菌。

　　家蚕中肠Toll基因既可以响应大肠杆菌又可以响应金黄色葡萄球菌(Wuetal.，2010a，b)，与本研究结果相似;而果蝇Toll基因只响应革兰氏阳性细菌和真菌(Buchonetal.，2014;曾令瑜等，2019)，表明小菜蛾和家蚕的Toll基因可能与果蝇的Toll基因在功能上存在差异。小菜蛾Toll-6基因对不同微生物的侵染具有不同的响应，经苏云金芽胞杆菌菌株Bt8010刺激6h后，Toll-6基因表达被显著抑制，表明苏云金芽胞杆菌可能通过抑制Toll-6基因的表达来逃避小菜蛾的免疫防御反应。

　　本研究中所使用的重组小菜蛾Toll6蛋白是通过大肠杆菌系统表达的，因此在研究其功能时，无法绝对排除由大肠杆菌宿主本身产生的残留细菌对蛋白的影响，后续研究中可以通过在大肠杆菌系统中表达一个已知无菌结合能力的其他蛋白，经过同样纯化后将其作为对照来排除这种影响，或者使用RNA干扰、规律成簇间隔短回文序列(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)及其相关Cas9蛋白介导的新一代基因编辑技术等进行体内基因敲除，与体外试验相互验证，从而明确该蛋白的功能。

　　参考文献(References)

　　AronsteinK,SaldivarE.2005.CharacterizationofahoneybeeTollrelatedreceptorgeneAm18wanditspotentialinvolvementinantimicrobialimmunedefense.

　　Apidologie,36(1):314BautistaMAM,MiyataT,MiuraK,TanakaT.2009.RNAinterferencemediatedknockdownofacytochromeP450,CYP6BG1,fromthediamondbackmoth,Plutellaxylostella,reduceslarvalresistancetopermethrin.InsectBiochemistryandMolecularBiology,39(1):3846

　　BuchonN,SilvermanN,CherryS.2014.ImmunityinDrosophilamelanogaster:frommicrobialrecognitiontowholeorganismphysiology.NatureReviewsImmunology,14(12):796810

　　作者：张姗姗1,2贾元虹1,2李金洋1,2林俊涵1,2,3尤民生1,2*夏晓峰1,2*

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