本文摘要：摘要:乙烯响应因子(ethyleneresponsivefactor，ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达，在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制，本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系，通过孢子悬浮液蘸根
摘要:乙烯响应因子(ethyleneresponsivefactor，ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达，在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制，本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系，通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理，抗病性鉴定结果表明，过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性，其病情指数为14.77，显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48h后，利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析，共得到273111170个cleanreads，其Q30均大于87.64%，将cleanreads与陆地棉参考基因组TM-1比对，获得了14021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比，转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程，67个DEGs参与防御反应，31个DEGs参与苯丙烷类生物合成，推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。
关键词:棉花;GhB301基因;枯萎病;功能;RNA-seq
棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)作为棉花的土传病害之一，其病菌可以从根部侵染棉花，毒害棉花维管束，造成棉花叶片青枯、落叶，甚至死亡。其病菌孢子在土壤中的休眠期长达10年之久，农药防治对病情控制的作用有限，并且会对土壤水源产生污染，因此培育棉花抗病品种是解决棉花枯萎病最为经济有效的措施。
近年来，较多的研究集中于棉花黄萎病，且主要集中在抗病种质资源的筛选、抗性基因的定位以及基因的遗传分析等方面[1-2]，而对棉花枯萎病的研究相对较少。随着高通量测序技术的迅猛发展，其具有时间短、通量大、灵敏度高等优点，在研究差异表达基因(Differentiallyexpressedgenes，DEGs)方面显示出强大的优势[3-4]。
第二代高通量转录组测序(RNA-seq)已被广泛应用于植物基因表达分析研究。韩泽刚等[5]通过Solexa高通量测序技术构建棉花抗、感枯萎病品种的基因表达谱，发现1080个DEGs在棉花抗病和感病品种中差异表达，并发现在植物激素信号转导通路中，26个已知功能的基因可能参与植物抗病反应。王琛等[6]通过分析比较接种和未接种枯萎病菌的棉花叶片转录组测序结果，发现枯萎病菌侵染后，5062个基因的表达量发生显著变化，其中2091个基因的转录水平升高，2971个基因的转录水平下降。杜荣光[7]通过对抗感枯萎病海岛棉材料接菌前后进行转录组测序分析，发现众多已知抗病相关基因均显著高表达。而这些研究均未对比分析转基因材料和对照材料。
本试验在前期研究中获得了1个ERF转录因子家族基因GhB301，在受到枯萎病菌诱导后，该基因的相对表达量明显增加，并且在抗病品种中的表达量显著高于感病品种;在烟草中过表达该基因，可以显著增加防御保护酶活性以及抗病相关基因的表达，暗示该基因可能在棉花对抗枯萎病菌胁迫响应中发挥重要作用[8]。在此基础上，本研究将GhB301转入陆地棉中并获得纯合株系，研究转基因棉花株系与野生型对照的抗病性变化，包括分析枯萎病菌诱导前后转基因系和对照系中的差异表达基因，筛选与棉花抗枯萎病菌相关的候选基因，在转录水平上分析GhB301基因在棉花抗枯萎病中的功能。
1材料与方法
1.1棉花枯萎病菌和植物材料的制备
棉花枯萎病菌7号生理小种F430菌株由石河子大学棉花分子育种实验室保存。棉花枯萎病菌在固体马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseager，PDA)培养基上培养5d后(28℃)，转移至查氏液体培养基中，于200r·min-1的孵育振荡器(哈尔滨东安电子)中，在28℃黑暗培养7～10d。最后用无菌水将孢子悬浮液的浓度调整至1×107个·mL-1，备用。以转GhB301基因棉花株系(N)与野生型受体YZ-1(WT)为材料，经硫酸脱绒的种子用10%的双氧水浸泡2～3h，无菌水冲洗5～6遍后，种植于无菌的营养钵(花土∶蛭石=2∶1)中。待棉苗长至第1片真叶完全展开时，进行伤根接菌处理从WT和N中分别采集枯萎病菌诱导后0、6、12、24和48h的棉花根部组织，液氮速冻后，保存于-80℃冰箱，用于转录组测序分析。
1.2表型鉴定与病情指数分析
接菌处理20d后，对N与WT进行抗病性鉴定(3次重复的植株分别为22、50和38株)。根据子叶和真叶的症状将棉花幼苗划分为5个等级(0、1、2、3、4级)，计算棉花植株的病情指数(diseaseindex，DI):DI=[(∑病级数×各级病株数)/(总株数×4)]×100[9-10]。利用SPSS和Excel2010软件对数据进行处理分析。
1.3RNA提取和转录组测序
参照RNAprepPurePlantKit(北京天根生化科技有限公司)说明书提取各处理样品总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的完整性及是否存在DNA污染，使用Qubit2.0Fluorometer(赛默飞，美国)对RNA浓度精确定量，使用Agilent2100bioanalyzer(Nanodrop，美国)精确检测RNA的完整性。使用Illumina的NEBNextUltraTMRNALibraryPrepKit(NEB，美国)试剂盒构建cDNA文库。使用Qubit2.0Fluorometer(赛默飞，美国)对文库进行初步定量，稀释文库至1.5ng·μL-1。使用Agilent2100bioanalyzer对文库的insertsize进行检测。库检合格后，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用IlluminaHiSeq4000进行测序。
1.4数据指控和参考基因组比对
对原始数据进行过滤，去除带接头、无法确定碱基信息以及低质量reads，得到cleanreads。对cleanreads分别进行Q20、Q30和GC含量计算。从CottonGene数据库下载陆地棉TM-1参考基因组[11]和基因模型注释文件，利用软件Tophat2[12]将高质量的cleanreads比对至参考基因组。
1.5基因表达量与注释
使用FPKM(expectednumberoffragmentsperKboftranscriptsequencepermillionsbasepairssequenced)来表示RNA-seq的基因表达值[13]。使用edgeR软件包[14](3.18.1)进行DEGs分析。当FPKM>1时认为该基因表达。以校正后的P值≤0.05以及|log2foldchange|≥2作为显著差异表达的阈值。利用clusterProfilerR软件(v3.10.1)进行DEGs的GO富集分析[15]和KEGG通路富集分析[16]。
1.6通过qRT-PCR验证
RNA-seq随机选取15个基因进行实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)验证，反应体系及程序参考北京全式金生物技术有限公司TransstartTipGreenqPCRSuperMix说明书进行，试验设3个重复。采用2-ΔΔCt法[17]计算基因相对表达量，所用引物见表1(用Primer5软件设计引物，由北京华大基因公司合成)。
2结果与分析
2.1表型鉴定及病情指数调查
N和WT接种枯萎病菌15d后，WT株系开始发病，N株系无明显病症;接菌第20天后WT和N植株均发病，对发病情况进行调查。结果表明，N株系中病级多分布在1级或2级，而WT株系中病级则多分布在3级及4级，且明显多于N株系，说明WT株系比N株系感染枯萎病菌的情况更为严重。对3次病级统计进行病情指数计算，发现WT棉花接种枯萎病菌后其病情指数平均值为37.50。而N株系接种枯萎病菌后其病情指数平均值仅为14.77。这说明GhB301基因的转入可以显著提高棉花对枯萎病菌的抗性。
2.2RNA-seq分析
转录组分析结果表明，共获得279114320个rawreads，过滤后保留273111170个cleanreads，数据量为81.95Gb，每个文库平均8.20Gb，WT棉花测序共得到131456222个rawreads，对低质量reads进行过滤后仍有128669540个cleanreads，其中cleanreads数最多的是N6，最少的是N48。
而N材料测序后共得到147658098个rawreads，过滤后剩余144441630个cleanreads，其中cleanreads数最多的是WT24，最少的是WT48。从测序结果可以看出，各样本文库的Q30值均超过87.64%，GC含量均大于43.06%，其平均值分别为89.86%和43.28%。将cleanreads比对到参考基因组中，发现比对率的均值是94.37%，其中最小的是N12，为92.94%，最大的是WT24，为94.95%，85.26%～87.56%的reads能够比对到参考基因组的唯一位置，但是仍有7.27%～8.10%的reads比对到参考基因组的多个位置。综合分析10个样本材料可以看出，平均有27311117个cleanreads以94.37%的平均比对率比对至参考基因组上，并且86.78%的cleanreads可以比对至参考基因组的唯一位置，为后续分析奠定了坚实的数据基础。
2.3DEGs筛选与注释
为了研究转基因棉花和野生型棉花接种枯萎病菌后不同时期的转录组情况，利用EdgeR进行差异表达基因的筛选，以P≤0.05，|log2foldchange|≥2为筛选条件，共发现14021个DEGs(其中1290个新基因)能够响应枯萎病菌诱导。对这些DEGs进行GO富集分析，共富集注释到30个亚类，涉及生物过程，细胞组成和分子功能三大类，主要富集在抗氧化活性、氧化还原酶活性、过氧化物酶活性、氧化应激的反应、光系统Ⅱ、碳水化合物结合以及细胞壁等功能类别，其中富集DEGs最多的是氧化还原酶活性(GO:0016684)，共注释到135个基因，最少的是光系统Ⅱ，仅注释到24个基因。
成对比较结果显示：野生型样本WT6、WT12、WT24、WT48与对照WT0相比，DEGs的数目分别为3494、4807、3137、3814个，WT12vsWT0的DEGs最多，WT24vsWT0的DEGs最少;而转基因样本N6、N12、N24、N48与对照N0相比，DEGs的数目分别为6019、5220、4859、2620个，N6vsN0的DEGs最多，N48vsN0的DEGs最少。比较发现，转基因株系在病原菌侵染后6h内大量的DEGs即开始做出响应，而野生型株系则需要12h。由此推测，转基因棉花在应对枯萎病菌胁迫时响应时更迅速，差异表达基因更多。
组间比较结果显示，N0vsWT0的DEGs有790个，N6vsWT6的DEGs最多，共有935个，N12vsWT12存在DEGs610个，N24vsWT24的DEGs最少，仅有607个，N48vsWT48存在918个DEGs。综上所述，WT组内比较发现共存在694个共同的DEGs，转N组内比较则有829个共同的DEGs。
组间比较结果显示，存在41个共同的DEGs，推测这些共同的DEGs可能与棉花枯萎病胁迫响应具有密切关系。其中，值得特别关注的是，Gh_A03G0673(MYB1R1)和Gh_A06G1626(抗病蛋白RPS5)在N植株中均不表达，而在WT植株中表达，推测转入GhB301基因可能促进ERF转录因子的表达而抑制MYB转录因子和PR基因的表达。Gh_A02G1734(戊二酸/铁依赖性双加氧酶)基因在N植株中的表达量均高于WT，推测转入GhB301基因可以提高氧化还原酶相关基因的表达。Gh_A13G2026(生长素应答蛋白SAUR32)只在N株系中表达，推测转入GhB301基因合影响棉花植株的生长发育。
2.4氧化还原过程中相关
DEGs活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)作为植物活性氧产生与清除的氧化还原产物，能够参与植物的生长发育及应激反应[18]。对DEGs进行GO富集分析，发现共有135个DEGs参与氧化还原过程(GO:0016684) 。
呼吸爆发氧化酶同系物(respiratoryburstoxidasehomologs，RBOHs)，又被称作植物NADPH氧化酶，在细胞生长、植物发育、植物对非生物环境约束以及与生物相互作用的反应中作为ROS生产者发挥作用，是重要的分子“中枢”[19]。本研究共鉴定出9个RBOHs参与氧化还原过程，即1个RBOHA(Gh_D08G1257)，2个RBOHB(Gh_D11G2743和Gh_A11G2426)，2个RBOHC(Gh_D07G0463和Gh_A07G0398)，3个RBOHD(Gh_A05G2211、Gh_D01G0990和Gh_D05G2471)，1个RBOHF(Gh_A12G2653)。其中RBOHB在2种材料中均呈现先上升后下降的趋势，在N株系中，其表达量在6h即达到峰值，WT中则在12h达到峰值。而RBOHC、RBOHD、RBOHF在N植株中呈现先下降后上升的趋势，在WT中则呈现持续下降的趋势。
对ROS清除剂抗坏血酸过氧化物酶(ascorbicacidperoxidase，APX)，过氧化氢酶(catalase，CAT)，过氧化物酶(peroxidase，POD)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPX)等进行表达模式分析，共检测到5种APX蛋白质基因(Gh_D13G2402、Gh_A06G0383、Gh_A08G1745、Gh_A02G1648、Gh_A01G1388)，这些基因在N株系中表达量均明显高于WT。
共鉴定到2种CAT基因(Gh_D03G0021和Gh_A05G1539)，在2种材料中均表现出先上调后下调的趋势;2种POD基因(Gh_A08G0714和Gh_D08G0832)，在N株系中上调表达，在WT中则先上调后下调;鉴定出3种GPX基因(Gh_A09G2408、Gh_D12G2260和Gh_A08G0673)，其在2种材料中的表达无明显变化。另外，鉴定得到2个1-Cys(1-Cysperoxiredoxin)基因(Gh_D10G1825和Gh_A10G1567)和2个DOX(alphadioxygenase)基因(Gh_A05G3137和Gh_D09G1660)，在N株系中的表达量均低于WT。综上，在ROS产生与清除过程中，众多DEGs参与其中，其表达量复杂多样的动态变化也反映出棉花在抵抗枯萎病感染的动态平衡中，氧化还原过程相关基因起着重要作用。
2.5植物防御反应相关
DEGs在植物与病原物长期演化过程中，植物产生了一系列防御反应机制来阻止病原物的侵害[20]。对所有DEGs进行GO富集，发现共有67个与防御反应(GO:0006952)相关的DEGs，共注释到33个PR10基因。这些PR10基因中存在20个MLP(majorlatexprotein)基因、7个BETV1(majorpollenallergenbetv 1)基因、4个NCS2(s-norcoclaurinesynthase2)基因、2个STH-2(pathogenesis-relatedproteinSTH-2)基因。Gh_D02G1678、Gh_A03G1240和Gh_D04G1394均注释为MLP423基因，前2个基因在2种材料中均呈现先上调后下调的趋势，而Gh_D04G1394在N株系和WT中的表达模式不同，其在N株系先上调后下调，而在WT中则先下调后上调。
3讨论
研究表明ERF转录因子与植物抗病响应密切相关[23]。ERF1作为ET/JA响应应答调控因子起作用，过表达ERF1的拟南芥对枯萎病菌抗性增强，ERF2也具有类似的功能[24]。在拟南芥中过表达B3亚组的 AtERF14基因能够增强防卫基因的表达，并且ERF14突变体对枯萎病菌表现为更易感病[25]。本研究通过抗病性鉴定，发现接种枯萎病菌后过表达GhB301转基因棉花与WT相比病情指数显著降低，表明转GhB301基因可以增强棉花的抗病性。
Fradin等[26]研究发现真菌孢子的萌发以及向表皮细胞的渗透一般发生在接菌后的0～12h。而植物的应激反应、信号转导和信息交换一般发生在真菌感染早期的40h左右[18，27]。本研究通过比较差异表达基因，发现接菌后6h时，转基因棉花中大量的差异表达基因开始响应，而WT棉花则在12h开始大量表达差异表达基因，说明转GhB301棉花能够更快响应枯萎病菌的胁迫，这些差异表达基因的提前响应可能会增强棉花的抗病性。在这些差异表达基因中，本研究重点关注了参与氧化还原过程、植物防御反应以及苯丙烷代谢途径的基因，其中氧化还原过程主要是植物产生和清除ROS的过程[19]。
本研究鉴定了9个呼吸爆发氧化酶同系物(RBOHs)，并且发现在N株系中的表达早于在WT中的表达。当植物受到病原菌等非生物胁迫时，植物在短时间内产生大量的ROS，如果无法及时清除ROS，则会伤害植株。本研究鉴定出多个调控APX、CAT、POD和GPX等防御保护性酶合成的基因，并发现在N株系中的表达量高于WT。研究表明，这些酶可以清除植物体内多余的ROS，从而保护植株免受枯萎病侵害[28]，本研究结果与其一致。在植物防御反应中共鉴定到33个PR10蛋白，而PR10蛋白是植物抵御外界生物胁迫与非生物胁迫产生的一类病程相关蛋白。植物在受到尖孢镰刀菌、黄萎病、青枯菌或者外源激素侵染后均能够诱导PR10蛋白的表达[29-31]。
本研究还发现了3个MLP423基因，而前人研究发现烟草NbMLP423通过内源激素信号途径参与调控烟草对赤星病的抗性及其他生物过程[32]。推测GhB301基因转入激活了植物防御反应从而提高了棉花对枯萎病的抗性。本研究还发现9个MLO基因，在2个材料中的表达量差异较大，说明转入ERF转录因子能够影响MLO基因的表达，而MLO基因在植物激素信号转导中发挥着重要作用[33]。
此外，Wang等[34]研究表明，NIMIN1.2可以通过介导在拟南芥中的氧化还原稳态和JA/ET途径来积极调控灰霉病的抗性。推测本研究发现的4个NIMIN-1基因可能通过茉莉酸/乙烯途径影响棉花对枯萎病的抗性。HSPRO2基因在植物防御反应中起重要作用，能够响应丁香假单胞菌的防御反应[35-36]。本研究检测到6个HSPRO2蛋白在N株系中的表达量高于WT，说明HSPRO2蛋白在棉花抵御枯萎病中发挥作用。
在苯丙烷代谢途径中，研究发现差异表达基因主要集中在BGLU、CAD和4CL等相关基因，其中BGLU基因作为香豆素合成的重要前体，其上调表达可以增加香豆素的含量。香豆素作为一种植物抗毒素，当植物受到病原菌侵染后迅速生成[37]。接种枯萎病菌后，BGLU相关基因表达量增加，表明转GhB301基因可能 通过增加植物抗毒素从而使棉花抗病性增强。综上所述，与WT相比，转GhB301的棉花中存在大量的DEGs，其在表达量及表达时效方面均呈现出较强优势，能够参与多种植物抗病反应，从而增强棉花对枯萎病的抗性。
4结论
对转基因棉花株系与野生型对照进行抗病性调查，发现过表达GhB301转基因的棉花株系对枯萎病的抗病性显著增强。对枯萎病菌侵染初期的棉花材料进行RNA-seq分析，发现了大量表达有关ROS产生和清除的氧化还原基因，以及与植物防御反应相关的基因，并筛选出多个可能与棉花抗枯萎病有关的候选基因。推测过表达GhB301基因在棉花抵抗枯萎病的动态平衡中发挥着重要作用。KEGG富集分析发现差异表达基因主要参与植物激素信号转导、植物病原体相互作用和苯丙烷生物合成等途径。本研究结果为揭示GhB301基因的功能及其调控网络奠定了基础。
参考文献：
[1]叶鹏盛，谭永久，李琼芳，曾华兰，韦树谷，李琼英.棉花高抗枯萎病抗源的持久抗性研究与利用[C]//中国植物病理学会会议论文集.浙江:中国棉花学会，2008:122
[2]王红梅.中国棉花枯、黄萎病发生危害及抗病育种成效[J].中国农学通报，2015，31(15):124-130
[3]王曦，汪小我，王立坤，冯智星，张学工.新一代高通量RNA测序数据的处理与分析[J].生物化学与生物物理进展，2010，37(8):834-846
[4]谢为博.基于表达谱芯片和新一代测序技术的高通量基因分型方法的开发[D].武汉:华中农业大学，2010
[5]韩泽刚，赵曾强，何兰兰，柴蒙亮，李会会，张薇.应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱[J].核农学报，2015，29(4):651-662
[6]王琛，王欣欣，王丽君，郭得政，郭兴启.Ⅱc族WRKY转录因子调控棉花枯萎病抗性的分子机理研究[C]//山东生物化学与分子生物学会会议论文集.天津:第八届泛环渤海生物化学与分子生物学会，2018:83
作者：刘戈辉1韩泽刚2孙士超1张薇1，*
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