本文摘要：摘要本研究利用二代测序技术IlluminaHiseq平台对飞蓬属(Erigeron)药用植物灯盏花(ErigeronBreviscapus)及其近缘种多舌飞蓬(Erigeronmultiradiatus)进行了叶绿体全基因组测序，通过生物信息学分析方法进行序列组装、注释和基本结构分析，并将其与19个已发表的植物叶绿体
摘要本研究利用二代测序技术IlluminaHiseq平台对飞蓬属(Erigeron)药用植物灯盏花(ErigeronBreviscapus)及其近缘种多舌飞蓬(Erigeronmultiradiatus)进行了叶绿体全基因组测序，通过生物信息学分析方法进行序列组装、注释和基本结构分析，并将其与19个已发表的植物叶绿体全基因组进行了系统发育分析。结果显示，叶绿体全基因组长度范围为152175~152372bp，大单拷贝区的范围为84684~84881bp，小单拷贝区的范围为18102~18133bp，两个反向重复区的范围为24667~24699bp。叶绿体全基因组中的GC含量范围为37.1%~37.2%，共注释到129个基因，其中蛋白编码基因(PCGs)84个，tRNA基因37个，rRNA基因8个。在飞蓬属叶绿体基因组中共检测到简单重复序列88~92个，长重复序列47~49个;此外，在变异热点区域筛选到9个高变片段。系统发育结果显示，多舌飞蓬与灯盏花以100%的支持率聚为一支，互为姊妹群。本研究结果将为灯盏花保护遗传学和资源开发利用等研究提供理论基础。
关键词灯盏花;多舌飞蓬;叶绿体基因组;SSR;系统发育
灯盏花(Erigeronbreviscapus(Vant.)HandMazz.)又名灯盏细辛和短葶飞蓬，为菊科(Compositae)飞蓬属(Erigeron)多年生草本植物，主要分布于中国云南、四川等西部和西南部海拔1200~3500m的中山和高山开阔山坡草地、林缘或疏林下(中国植物志编辑委员会,1985,科学出版社,pp.308)。灯盏花药材味辛、微苦，性温，归心、肝经。具有散寒解表、祛风除湿、舒筋活血、消积止痛等功效(中国药典委员会,2020,中国医药科技出版社,pp.154)。
现临床上主要用于心脑血管疾病及其后遗症、瘫痪等治疗。灯盏花作为治疗心血管病的原料药，是云南的道地药材之一。灯盏花成片分布的地区很少，随着人们对灯盏花药材需求量的不断增加以及对野生资源量的过度采集，野生资源蕴藏量已不能满足人类需求和企业生产的需要。
灯盏花种子细小、世代周期短，品种极易退化，而且其严格的自交不亲和性也容易引起品种的混杂退化，因此，需要不断筛选优良野生种源，培育成分专用型新品种，扩大新药源以满足药材生产的需求(李锐等,2019)。多舌飞蓬(Erigeronmultiradiatus(Wall.)Benth.)与灯盏花为同属植物，分布于中国四川和云南等地，常生长于海拔2500~4600m亚高山和高山草地、山坡和林缘;资源丰富，在藏医药中以全草入药。
一般来说，植物物种之间的亲缘关系越近，所含的化学成分也越相近。因此，利用植物类群之间的亲缘关系，就能较快地发现新药源和替代品。已有报道对灯盏花及其近缘种多舌飞蓬进行质量评价，得出多舌飞蓬质量尚可，有替代灯盏花药材的可能(肖琳婧等,2019)。 叶绿体是植物中重要的细胞器，在光合作用和碳固定中起着关键作用，现在普遍认为叶绿体起源于内共生蓝藻，具有自主遗传基因组(Dyalletal.,2004)。研究表明，大部分被子植物的叶绿体基因组具有典型的环状四分体结构(张明英等,2020)。
包括：1个大单拷贝区(largesinglecopyregion,LSC)、1个小单拷贝区(smallsinglecopyregion,SSC)以及2个反向重复区(invertedrepeatregions,IRa/IRb)，大小一般在120~220kb，大约包括130个基因，主要包括3类：与基因表达相关的基因，与光合作用相关的基因和RNA基因(Yangetal.,2017)。与核基因组和线粒体基因组相比，叶绿体基因组具有结构保守、单亲遗传不存在重组、序列变异度适中等特点，是分子生物学研究中的重要工具(Jansenetal.,2007)。
自从1986年叶绿体全基因组在烟草(Shinozakietal.,1986)、地钱(Ohyamaetal.,1986)中首次公布以来，现在已经超过3300条叶绿体基因组被GenBank收录(姜汶君等,2020)。叶绿体全基因组序列的测定不仅加速了物种在进化、迁徙方面的研究，还对物种的鉴定、分子标记、系统发育等研究起着巨大的推进作用(武立伟等,2020)。
本研究基于二代高通量测序技术和生物信息学分析方法，对不同居群灯盏花及其近缘种多舌飞蓬进行叶绿体全基因组测序、组装、注释，并且对其序列变异和结构特征进行解析，并选择了17个已发表的菊科植物，2个与菊科亲缘关系较近的桔梗科植物(外类群)叶绿体全基因组进行了系统发育分析。旨在为灯盏花的资源开发利用、飞蓬属植物种间系统发育关系、物种鉴定以及寻找新药源等研究奠定了基础。
1结果与分析
1.1灯盏花、多舌飞蓬叶绿体全基因组基本特征及分类灯盏花、多舌飞蓬具有与大多数被子植物叶绿体基因相似的环状四分体结构。不同居群灯盏花的叶绿体全基因组长度范围为152175~152372bp，多舌飞蓬叶绿体全基因组长度为152281bp，GC含量范围为37.1%~37.2%;灯盏花大单拷贝区(LSC)长度为84684~84881bp，小单拷贝区(SSC)长度为18102~18133bp，两个反向重复区(IRa/IRb)范围为24667~24699bp;多舌飞蓬的LSC长度为84789bp，SSC长度为18110bp，IR区长度为24691bp。所有居群叶绿体基因组均注释到129个基因，其中蛋白编码基因(PCGs)84个，tRNA基因37个，rRNA基因8个。
灯盏花与多舌飞蓬基因分类情况，根据其功能可以将它们分为3类：第一类是与光合作用系统有关的基因，包括光系统I基因(5个)、光系统Ⅱ基因(15个)、NADPH氧化还原酶基因(11个)、二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因(1个)、ATP酶基因和细胞色素b/f复合体基因各6个;第二类是与转录、翻译有关的基因，包括核糖体RNA基因(4个)、转运RNA(tRNA)基因(30个)、RNA聚合酶亚基基因(4个)、核糖体蛋白基因(21个)和翻译起始密码子基因(1个)等;第三类是与其他生物合成相关的基因，如matK、ccsA等。
在这些基因中含有17个双拷贝基因，包括1个ATP酶基因(atpF)、2个细胞色素b/f复合体基因(petB,petD)、2个NADPH氧化还原酶基因(ndhA,ndhB)、1个RNA聚合酶亚基基因(rpoC1)、核糖体蛋白大/小亚基基因各2个(rpl2,rpl16,rps12,rps16)、6个转运RNA基因(trnAUGC,trnGUCC,trnIGAU,trnKUUU,trnLUAA,trnVUAC)、未知功能基因1个(ycf3)。
1.2长重复序列及SSR分析
本研究利用在线微卫星识别软件MISA，在灯盏花和多舌飞蓬叶绿体基因组中共检测到简单重复序列(simplezsequencerepeat,SSR)88~92个。其中单核苷酸重复(Mononucleotides)32~36个(34.78%~40.45%)，二核苷酸重复(Dinucleotides)19~23个(20.88%~25.00%)，三核苷酸重复(Trinucleotides)14~15个(15.91%~16.85%)，四核苷酸重复(Tetranucleotides)13~16个(14.61%~18.18%)，五核苷酸重复(Pentanucleotide)4~6个(4.35%~6.74%)，六核苷酸重复(Hexanucleotide)除居群ML、SM、XW检测到1个外(1.09%~1.12%)，其余居群未检测到。
除SSRs外，长度≥30bp的重复被认为是长重复序列。对本研究的6个居群进行长重复序列检测，除SM居群检测到47个长重复序列外，其他居群均检测到49个长重复。多舌飞蓬总的49个长重复，包括23个回文重复、19个正向重复、6个反向重复、1个互补重复;灯盏花的回文重复为22~23个，正向重复17~19个，反向重复4~8个，互补重复1~3个。这些重复序列中大部分序列在基因间隔区，长度在30~42bp之间。
2讨论
灯盏花是云南重点开发的“五大天然系列”药物之一，由于其在心脑血管系统疾病上具有较高的药用价值，在医药生产方面需求较大。目前，灯盏花人工种植现已初具规模，为了保证其原材料的品质和稳定性，已有报道通过RADP(周利杰等,2005;杨生超等,2008)、DALP(刘洁,2006)、ISSR(杨生超等,2010)、灯盏花DNA指纹图谱(熊勇等,2012)、AFLP(张薇等,2013)等分子手段为灯盏花育种提供了理论依据和育种素材。
本研究基于叶绿体全基因组及系统发育分析的角度，对上述研究进行补充。基于二代高通量测序技术和生物信息学分析方法对灯盏花及其近缘种多舌飞蓬叶绿体全基因组进行了分析研究。结果显示，灯盏花、多舌飞蓬均具有被子植物叶绿体基因组典型的四分体结构，所编码的基因数量、类别和排列顺序高度一致，基因组序列总长152175~152372bp，叶绿体基因组总共编码129个基因，其中蛋白编码基因(PCGs)84个，tRNA基因37个，rRNA基因8个。
叶绿体全基因组中的GC含量范围为37.1%~37.2%，这与大多数被子植物叶绿体基因组具有31.0%~38.0%的GC含量相似，如椭圆叶花锚(王虹雨等,2021,私人通信)、花园君子兰(吴海红等,2021,私人通信)、平托花生(张小利等,2021,私人通信)等。在SSC、LSC和IR区的GC含量表现出明显的差别，分别为31.0%、35.0%~35.1%、43.1%~43.2%。IR区的GC含量较高可能是由于该区域的rRNA基因具有高水平的GC值，而SSC区的低GC含量可能与位于该区域的NADH相关(Zhengetal.,2006)。
叶绿体基因组中的SSRs因含量丰富、多态性高，且为母系遗传等优点而被作为分子标记广泛用于物种群体遗传学(Jayaswalletal.,2021)、谱系地理学(Chmielewskietal.,2015)等研究。本研究通过在线软件分析共得到灯盏花、多舌飞蓬简单重复88~92个，长重复47~49个，这些重复序列可以为灯盏花、多舌飞蓬的遗传多样性及保护遗传学等相关研究提供候选分子标记。
IR区边界的扩张和收缩被认为是被子植物叶绿体基因组大小变化的主要原因。本研究通过对灯盏花与多舌飞蓬叶绿体基因组IR/SC边界分析发现，灯盏花与其近缘种多舌飞蓬叶绿体基因组IRs区大小和基因组成高度保守。被子植物叶绿体基因组序列中的一些高变异区由于其序列短，能作为DNA条形码经济、快速的区分不同属的植物，往往可以作为物种鉴定及系统发育关系分析等相关研究的分子标记(Lietal.,2019)。
基于mVISTA和DNAsp软件分析结果显示，在7个非编码区(rps2atpI,trnTpsbD,trnTtrnL,ndhCatpE,ndhFtrnL,trnTUGUtrnLUAA,ccsAndhD)和2个编码区(ycf3,ndhD)存在明显变异。这些区域可能在物种水平上进行更快速地核苷酸取代，了解和掌握这些变异热点，不仅有利于理解飞蓬属叶绿体基因组进化特点，而且基于这些序列片段设计分子标记，可为灯盏花分子鉴定的DNA条形码筛选提供参考。 本研究利用从NCBI下载的17条菊科、2条桔梗科植物(外类群)的叶绿体基因组序列以及本试验测得的5个灯盏花和1个多舌飞蓬叶绿体基因组序列构建ML系统进化树，以探讨灯盏花和多舌飞蓬的系统进化位置关系。结果以100%的支持率把多舌飞蓬与灯盏花聚为一支，互为姊妹群。
综上所述，灯盏花与多舌飞蓬叶绿体基因组结构特征相似，序列差异较小。因此，本研究从叶绿体基因组角度认为多舌飞蓬可作为灯盏花的替代品。此研究结果进一步支持了肖琳婧等(2019)对灯盏花及其近缘种质量评价研究得出的结论。本研究对灯盏花及其近缘种多舌飞蓬叶绿体全基因组测序及系统发育分析不仅丰富了菊科植物叶绿体基因组序列的数量，同时为飞蓬属物种鉴定、系统发育、筛选优良种质及选取替代药材、实现该药用植物的可持续利用提供理论基础。
3材料与方法
3.1试验材料
采集飞蓬属内的两个种，其中灯盏花(Ebreviscapus)5个野生居群，多舌飞蓬(E.multiradiatus)1个野生居群。样品由云南中医药大学李国栋副教授鉴定。采集到的新鲜幼嫩叶片放入硅胶中快速脱水干燥，用于基因组DNA提取。凭证标本存放于云南中医药大学中药材优良种苗繁育工程研究中心。
3.2基因组
DNA提取与测序取新鲜幼嫩叶片，利用植物基因组DNA提取试剂盒(BioTeke公司,北京)提取总DNA。使用琼脂糖凝胶电泳和NanodropOne超微量分光光度计检测DNA质量及浓度。将检测合格的DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司采用IlluminaHiSeq2500PE150平台进行建库测序。
参考文献
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作者：田星1李中霁1刘小莉2*李国栋1*
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