本文摘要：摘要：设计不同浓度的CaCl2溶液，在对菠菜(Spinacia oleracea L.)盐胁迫前采用根部浇灌和叶部喷施的方法进行诱导，钙诱导5 d后，对菠菜幼苗再进行150 mmol/L NaCl溶液处理，测定其形态建成和生理生化指标。结果表明，外源钙能显著提高盐胁迫下菠菜的形态建成
摘要：设计不同浓度的CaCl2溶液，在对菠菜(Spinacia oleracea L.)盐胁迫前采用根部浇灌和叶部喷施的方法进行诱导，钙诱导5 d后，对菠菜幼苗再进行150 mmol/L NaCl溶液处理，测定其形态建成和生理生化指标。结果表明，外源钙能显著提高盐胁迫下菠菜的形态建成指标;显著增加可溶性蛋白质和叶绿素含量;显著提高SOD和POD活性;显著降低丙二醛(MDA)和游离脯氨酸含量。当外源钙离子浓度为30 mmol/L时，其降低盐胁迫伤害效应的效果较好。
关键词：菠菜(Spinacia oleracea L.);盐胁迫;外源钙;化学诱抗剂;生理效应
随着盐碱地面积的不断增加和土壤盐渍化程度的日益加剧，农作物的生产受到极大影响，土壤盐渍化成为制约农业生产的重要因素[1]。另外，随着工业污染的加剧、海水的盲目开发利用、化肥的大量投入以及设施生产的迅猛发展，导致了土壤次生盐渍化加重[2]，土壤盐渍化已成为设施栽培中普遍存在的问题。对北京、济南、上海、江苏等地大棚土壤调查发现，大棚土壤普遍存在着不同程度的次生盐渍化现象，己严重影响了蔬菜作物的生长发育[3]。盐胁迫对植物的影响机理可综合为阻碍植物的生长发育[4]、造成渗透胁迫[5]、离子失衡[6]、活性氧伤害[7]、营养亏缺[8]和抑制光合作用[9]等。目前，针对盐害可采取2种措施来进行改良，一是改良土壤;二是进行农作物耐盐育种和栽培，提高农作物的耐盐性。而利用生物措施来治理盐害被普遍认为是最经济有效的方法[10]。化学诱抗剂一般是指能够诱导植物产生抗逆反应的化学物质，也称为抗逆诱导子或抗逆激发子，具有无毒、无害、无污染的特点，因而采用化学诱抗剂提高作物耐盐性是与发展可持续农业相适应的一项重要绿色生产技术。Ca2+作为植物必需的一种矿质营养元素，在保护植物细胞膜结构和功能的完整性、稳定细胞壁结构、调节离子运输和选择性、控制离子交换行为和细胞壁中酶活性中扮演了关键角色[11]。近年来，研究发现Ca2+参与盐胁迫等多种逆境胁迫过程，施加钙一方面可以缓解因Ca2+不足而引起的矿质营养胁迫，另一方面可以增强质膜的稳定性和钙信号系统的正常功能，阻止细胞内K+的外流和Na+的大量进入，以维持细胞内离子平衡，从而提高植物的抗盐性[12]。
菠菜(Spinacia oleracea L.) 是一种重要的叶菜类蔬菜，营养丰富[13]， 在世界范围内均有较大栽培面积。菠菜为中等耐盐作物，但是在盐碱地栽培及次生盐渍化比较严重的大棚栽培生产中，盐胁迫严重影响了其产量与品质。有关外源钙离子作为化学诱抗剂能否提高盐胁迫下菠菜耐盐性、其运用效果如何等方面的研究还未见报道。因此，本研究设计了6个不同浓度Ca2+进行诱导，研究了外源钙离子诱导后对盐胁迫下菠菜幼苗的形态建成、生理生化指标的影响，探讨了其降低菠菜幼苗盐害效应的生理生化机制，为充分利用盐碱地种植蔬菜，减轻设施园艺生产中土壤次生盐渍化问题，培养健壮幼苗并提高其耐盐性等方面提供依据。
1 材料与方法
1.1 种苗培养
以日本春秋大叶菠菜为试验材料，将菠菜种子播于塑料营养钵中，采用基质草炭∶蛭石=2∶1(体积比)，每立方米加入腐熟膨化鸡粪5 kg、三元素复合肥1.5 kg，用50%多菌灵100 g/m3消毒。待幼苗长到有6片真叶时，移入装有相同基质的塑料盆。
1.2 材料处理
菠菜移栽10 d后，进行根际初始诱导，诱抗剂CaCl2的浓度分别设为0、10、20、30、40、50 mmol/L，共6个处理，每个处理3次重复。用根灌法在幼苗根部浇入不同浓度的CaCl2，每株20 mL;初始诱导2 d后叶面喷施进行强化诱导，用手持小喷雾器，均匀喷洒幼苗叶部，以量足但不滴为准。强化诱导3 d后施加盐胁迫，用根灌法把150 mmol/L NaCl溶液缓慢注入根际基质中，每盆40 mL，早晚各胁迫1次。
1.3 指标测定与数据分析
盐胁迫后第5天取样进行菠菜形态建成指标和生理生化指标的测定。测定幼苗株高(子叶节到生长点之间的距离)、茎粗(茎基部)、展开叶片数、全株鲜重及全株干重，记录数据最后计算出壮苗指数。
壮苗指数=茎粗/株高×全株干重
叶绿素含量的测定采用SPAD法测定;丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT光化还原法;过氧化物酶(POD)采用愈创木酚比色法测定;可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法;游离脯氨酸活性的测定采用茚三酮法。试验数据采用DPS统计软件进行方差分析，并对平均数采用LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 外源Ca2+对NaCl胁迫下菠菜形态建成指标的影响
由表1可知，不同浓度的Ca2+诱导对盐胁迫下菠菜生长发育的影响存在显著差异。其中，30 mmol/L的Ca2+诱导下菠菜长势最好，未用Ca2+诱导的菠菜长势最差。其中株高、展开叶片、干重和壮苗指数中，30 mmol/L Ca2+处理与其他各浓度处理相比差异均达到显著水平。表明施用Ca2+浓度为30 mmol/L时，能显著促进盐胁迫下菠菜的生长发育和提高壮苗指数，有效缓解和减轻菠菜的盐害效应，而较高浓度的Ca2+则显著降低了壮苗指数，反而对菠菜幼苗的形态建成不利。
2.2 外源Ca2+对NaCl胁迫下菠菜叶片中叶绿素和可溶性蛋白质含量的影响
盐胁迫下，外源钙离子对菠菜叶片中叶绿素和可溶性蛋白质含量的影响存在差异(图1)。对于叶绿素含量而言，与对照相比低浓度的外源Ca2+对叶绿素含量影响不显著，但是当其浓度增加到30 mmol/L时，则可以显著提高菠菜叶片叶绿素含量;而进一步提高外源Ca2+浓度其作用效果呈明显下降的趋势。由此可见，当遭受盐胁迫时，外施浓度为30 mmol/L Ca2+可使菠菜叶片叶绿素正常合成，从而缓解叶片盐胁迫下光合作用的降低。对于可溶性蛋白质含量来说，低浓度Ca2+诱导后，幼苗叶片中可溶性蛋白质含量与对照相比差异未达到显著水平(图1)，表明外施低浓度的外源钙离子没有达到其效果;而较高浓度的Ca2+诱导后，其含量反而比低浓度处理的显著降低。当外源钙离子为30 mmol/L时，可以显著增加菠菜叶片可溶性蛋白质的含量。
2.3 外源Ca2+对盐胁迫下菠菜叶片中MDA和游离脯氨酸含量的影响
与对照相比，使用外源Ca2+诱导后可显著降低盐胁迫下菠菜叶片中MDA的累积(图2)。但不同浓度的Ca2+诱导处理之间差异不显著，说明不同Ca2+浓度的诱导均能有效降低菠菜叶片中的MDA含量。对于游离脯氨酸而言，10～20 mmol/L的外源Ca2+诱导下其处理之间差异未达到显著水平，但是当外源Ca2+诱导浓度提高到30 mmol/L-1时，则可显著增加菠菜叶片中游离脯氨酸的含量;而进一步增加Ca2+诱导浓度，其作用效果则明显下降(图2)。
2.4 外源Ca2+对盐胁迫下菠菜叶片中SOD和POD活性的影响
外源Ca2+对盐胁迫下菠菜叶片中SOD和POD活性的影响见图3。从图3可知，随着外源Ca2+诱导浓度的增加，菠菜叶片中SOD和POD活性呈先升高后降低的趋势。使用一定浓度范围内的外源Ca2+诱导可显著增加SOD和POD活性。对于SOD，10 mmol/L的Ca2+诱导浓度与对照相比能显著提高菠菜叶片SOD活性， 但与20 mmol/L Ca2+诱导浓度处理间差异不显著。而20～40 mmol/L Ca2+诱导浓度处理间差异也未达到显著水平。当Ca2+浓度增加到50 mmol/L时，反而使SOD活性显著降低。当Ca2+浓度为30 mmol/L时，菠菜叶片POD活性达到最高值，与其他处理间差异显著。
3 讨论
盐胁迫是影响作物生长和降低作物产量的主要障碍因子之一。从形态建成指标来看，盐分对非盐生植物的胁迫效应就是阻止其生长[14]。在本试验中，NaCl胁迫使菠菜的生长受到严重抑制，而通过使用外源Ca2+进行诱导后可显著缓解这种抑制作用，且能显著增加干物质的积累和提高壮苗指数，增强植株的耐盐性。但过高浓度的Ca2+进行诱导后其作用效果反而显著下降，可能是CaCl2也作为一种盐分，增加了土壤根际中的Cl-，抑制根系对NO3ˉ等阴离子养分的吸收[15]。
研究表明，各种细胞器中受盐分影响比较敏感的是叶绿素[16]。盐胁迫条件下，NaCl能增强叶绿素酶的活性， 加速叶绿素分解。本研究中，使用30 mmol/L以上外源Ca2+后可显著提高菠菜叶绿素含量，这与在芸薹属植物上的研究结果一致[17]。CaCl2能提高叶绿素含量，其可能的机理是CaCl2能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延缓叶绿素含量的下降，增强菠菜对盐胁迫的适应，提高叶片捕捉和利用光能的能力。此外，外源钙能提高菠菜叶片中的可溶性蛋白质含量，这与刘雪琴等[18]在玉米上的研究结果一致。
盐胁迫下MDA含量的增加可能是活性氧(ROS)所导致的氧化胁迫对细胞膜结构的破坏[19]，而外源Ca2+减少或阻止盐胁迫下Na+对Ca2+的替换，从而提高了膜的流动性、减少了活性氧的产生[20]以及抑制了膜脂的过氧化，以维持细胞膜正常的结构，保证植物体各种代谢循环的正常进行。另外，游离脯氨酸作为一种重要的渗透调节物质，在逆境条件下大量累积[21]，待逆境解除后主要用来参与叶绿素的合成，随着逆境的缓解很快减少。本研究中采用外源Ca2+进行诱导后，可以显著提高菠菜幼苗叶片中游离脯氨酸的含量，与陈淑芳等[22]在黄瓜上的结论一致。脯氨酸的积累一方面可以增加细胞的渗透调节能力，另一方面又可以避免细胞氨中毒。盐胁迫下外源Ca2+能显著提高菠菜幼苗叶片中游离脯氨酸的含量，是否是因为其参与了脯氨酸积累的信号转导作用还值得深入研究。
对于POD来说，其影响趋势与SOD相似，但是Ca2+诱导浓度为40 mmol/L时，POD活性就明显降低。植物在遭受逆境胁迫时会引起氧化胁迫的产生[23]，导致生成活性氧(ROS)而破坏植物组织及细胞。植物体内的抗氧化系统，如SOD、POD等可有效减少这些活性氧的破坏作用。而采用外源Ca2+能显著提高盐胁迫下菠菜幼苗叶片中的SOD与POD活性，这与其他研究结果一致[24]。因此，外源Ca2+通过提高菠菜幼苗叶片中这些保护酶的活性，增强了清除活性氧的能力，从而减少其对膜结构和功能的破坏。
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