本文摘要：摘要 为探究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化循环水养殖系统的养殖水体水质情况以及微生物菌群的组成结构，本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析手段，测定凡纳滨对虾工厂化循环水养殖过程一级移动床生物净化、二级固定床生物净化、养殖水体的水质指标、水
摘要 为探究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化循环水养殖系统的养殖水体水质情况以及微生物菌群的组成结构，本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析手段，测定凡纳滨对虾工厂化循环水养殖过程一级移动床生物净化、二级固定床生物净化、养殖水体的水质指标、水体和生物净化载体以及对虾肠道微生物菌群的组成。结果显示，水体的氨氮(NH4+-N)和亚硝酸盐氮(NO2–-N)质量浓度显著降低，分别为 0.85 和 0.21 mg/L。养殖系统水体、生物净化载体和虾肠道样品中共有的优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，此外，一级、二级生物净化系统水体中的放线菌门(Actinobacteria)为优势菌，生物净化载体中浮霉菌门(Planctomycetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)为优势菌;对虾肠道中的厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌。另外，对虾养殖循环水系统中生物净化载体上的细菌物种含量比水样中的细菌物种少，但微生物多样性高于养殖水体，生物净化载体中微生物具有低丰度和高多样性的特点。综上所述，生物净化系统可有效地增加水体中促进氮、磷代谢的微生物菌群，调控养殖水体的水质指标，研究结果为凡纳滨对虾工厂化循环水养殖系统构建及水质调控提供理论依据。
关键词 凡纳滨对虾;工厂化循环水养殖;生物净化;水质指标;微生物菌群
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国最重要的对虾养殖品种，2020 年凡纳滨对虾海水养殖产量达 119.7 万 t，占全国虾类海水养殖总产量的 80.5%(农业农村部渔业渔政管理局等, 2021)。凡纳滨对虾养殖产业的发展经历了池塘养殖、温棚养殖、高位池养殖、工厂化养殖等养殖模式(朱林等, 2019)。
随着凡纳滨对虾集约化养殖技术的不断发展，放养密度和饲料投喂量的增加，养殖动物的产量和养殖水域的利用率明显提高(陈明康等, 2020)，但是大量残饵、粪便、肥料和药物的投入使养殖水环境日益恶化，负面环境效应非常突出，导致对虾疫病肆虐横行、环境污染严重(祁真等, 2004)。因此，发展无公害生态养殖，推动工厂化循环水养殖，高效可持续的生物净化系统研究已成为当今凡纳滨对虾集约化养殖研究的热点之一。
循环水养殖模式是将养殖水经物理、化学及生物净化处理后重复使用的新型养殖方式(王峰等, 2013)，在水资源节约、养殖废弃物处理、对虾疾病控制以及减少生态污染等方面具有明显的优势(张龙等, 2019;张健龙等, 2017)。生物净化是循环水水处理的核心环节，滤料是生物净化设施的重要组成部分，不同滤料因为材质、比表面积、耐冲刷能力、水力特性等差异造成其表面生物群落的不一致，从而影响对养殖水的处理效果(蔡云龙等, 2005)。
而养循环水养殖系统中的有益微生物菌群在净化水质、降低氨氮(NH4+-N)和亚硝态氮(NO2–-N)(邵青等, 2001; Fan et al, 2018)、营养循 环(Cornejo-Granados et al, 2018)、病原 防控(Rungrassamee et al, 2016)及养殖物种健康(樊英等,2017)等方面也发挥着重要的作用。目前的研究主要集中在生物净化滤料的单因素对水质的效应研究，其对环境及养殖对虾微生物菌群的研究较少。因此，本研究通过分析对虾工厂化循环水养殖系统中水质指标、水体及对虾肠道微生物菌群结构的变化，探讨工厂化循环水系统生物净化对水体养殖对虾的影响效果，为对虾工厂化循环水养殖系统和养殖模式的构建提供基础参数。
1 材料与方法
1.1 养殖系统的组成与构建
实验在海阳市黄海水产有限公司养殖基地进行，对虾工厂化循环水养殖系统由原石斑鱼(Epinephelinae)养殖车间进行升级改造，总面积为 800m2，有效养殖水体为 600 m3。8 个规格相同的水泥养殖池(长 9 m、宽 9 m、深 2 m, 养殖水体 600 m3)通过回水管道和进水管道与水处理系统相连构成封闭循环水养殖系统。水处理系统是由中国水产科学研究院海水陆基工厂化养殖创新团队自主设计构建。
主要由2 个养殖池改建而成，一个养殖池分隔成泵池、微滤机池、一级移动床生物净化池和综合调节池 4 部分，一级移动床生物净化池生物滤料为多孔 PE 填料(比表面积约 600 m2/m3);另一个养殖池分隔成二级固定床生物净化池、紫外消毒池和集中增氧池 3 部分，二级固定床生物净化池生物滤料为立体弹性填料(比表面积约 150 m2/m3)。整个养殖系统配备 2 台 3.0kW、气压为 39.2 kPa 的罗茨鼓风机，满足对虾工厂化养殖 6.0 mg/L 以上的溶氧和生物净化所需的溶氧与曝气要求，养殖系统工艺流程。养殖用水为天然海水，经沉淀、砂滤、调温、增氧处理后使用。
1.2 实验设计实验
凡纳滨对虾苗种由海南正泰一号水产种苗有限公司培育，实验于 2020 年 10 月 16 日开始，初始放养密度为 500 尾/m3，虾苗平均体质量为(0.6±0.1)g。各组养殖水循环量为 6 h 循环 1 次，每天 4 个循环，每天补充水量为水体的 3%左右。根据对虾的生长情况，投喂不同颗粒大小的青岛正大农业发展有限公司生产的凡纳滨对虾配合饲料(粗蛋白≥42%、粗脂肪≥4%、粗纤维≥3%)。
养殖实验初期 22 d，投喂粒径为 0.5 mm 的配合饲料，22 d 后，投喂粒径为 1 mm的配合饲料，4 次/d，投喂时间分别为 07:00、12:00、17:00 和 22:00，日投喂量为对虾体重的 10%，养殖后期投饲率降至 4%。在养殖实验的第 80 天，采集一级移动净化池水体(FMW)、二级固定床生物净化池水体(SIW)、养殖池水体(PC)以及多孔 PE 填料(FMB)、立体弹性填料(SIB)和对虾肠道样品。
在上午投喂 4 h 后，从每个处理池分选择池中心以及周边两点采集水面以下 50 cm处的水样 500 mL，用 0.22 µm 聚碳酸酯过滤器过滤，滤膜放入无菌离心管–20℃冷冻保存用于分析微生物菌群结构，过滤后的水用于测水质指标;取一级移动床生物净化池多孔 PE 填料 5 片，取二级固定床生物净化池立体弹性填料 10 cm，分别用 500 mL 纯净水进行振荡、抽滤，滤膜放入无菌离心管–20℃冷冻保存用于分析微生物菌群结构。随机从 8 个养殖池中挑选 18 尾对虾，分别采集肠道(LVT)样品，混合成 3 个样品放入无菌离心管，–20℃冷冻保存，用于分析微生物菌群结构。
1.3 测定与计算方法
1.3.1 水质指标 水体的水温、溶氧、pH 和盐度利用水质检测仪(YSI556, 美国)测定;总氮(TN)、硝态氮(NO3–-N)、亚硝态氮(NO2–-N)和氨氮(NH4+-N)的浓度利用营养盐流动分析仪(Skalar, 荷兰)测定。
1.3.2 微生物菌群检测 水体和对虾实验样品中的微生物总 DNA 的提取采用 TAB/SDS 法进行，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品的基因组 DNA，检测出清晰的 DNA 条带，然后用 NanoDrop 2000c 微量核酸检测仪 NC20 检测其 DNA 纯度，其 OD260 nm/OD280 nm=1.9~2.0，符合 Ilumina MiSep 测序要求。使用 16S rDNA基因 V4 区带有 barcode 的特异引物对 DNA 进行 PCR扩增，引物为 515F (5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR扩增在 ABI GeneAmp® 9700 型 PCR 仪中进行。PCR反应体系为 30 μL，包括 DNA 模板 10 ng、15 μL ofPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix、0.2 μmol/L正反向引物。
PCR 反应程序为 98℃ 1 min;98℃10 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，30 个循环;72℃ 5 min。PCR扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测，等比例混合后，利用 GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)纯化回收目的片段。使用 NEB Next® Ultra™ DNALibrary Prep Kit for Illumina (NEB, 美国)进行测序文库构建。测序文库经 Qubit@ 2.0 Fluorometer (ThermoScientific)和 Agilent Bioanalyzer 2100 system 检测合格后，在 Illumina MiSeq 平台进行测序。
1.3.3 生物信息学分析
利用 FLASH 软件对基于barcode 所得样品的有效序列进行质控过滤。使用UPARSE 软件进行序列分析，并以≥97%的相似度定义操作分类单位(OTUs)。使用 UCHIME 软件确定嵌合序列。利用 Mothur 软件使用 97%相似度的 OTUs，利用 R 语言工具绘制所有微生物样本稀释曲线。使用Mothur 软件根据 Chao1、辛普森(Simpson)和香浓(Shannon)指数计算菌群 α-多样性。使用 R 语言工具分析和绘制维恩(Venn)图，用于分析各组微生物样本共有和独有的 OTUs 数量。使用 R 软件包基于加权和非加权 unifrac 距离的主坐标进行降维分析(PCoA)评估菌群 β-多样性。
利用 R 语言工具在门和属水平上分别统计细菌群落相对丰度。利用 Metastats 软件分析各组细菌分类学的丰度差异。采用 LEfSe 软件，使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析，对不同组内的生物标志物进行定量分析。根据各个 OTU 的丰度概况，使用 Cytoscape 软件构建菌群生态网络。使用 RandomForest 软件包进行 RandomForest 分析。生物信息学分析由明科生物技术(杭州)有限公司提供技术支持。
1.3.4 数据分析
所得数据以平均值±标准误(Mean±SE)表示，采用 SPSS 25.0 软件进行方差分析(ANOVA)和多重比较(LSD 法和 Duncan 法)，P<0.05表示差异显著。
2 结果
2.1 生物净化系统对养殖水体水质的影响
生物净化对循环水养殖系统水体无机营养盐和有机质含量质量浓度的影响。净化池和养殖池的水温保持在 28.5℃左右，盐度为 31 左右，pH 为7.8~8.2，溶氧保持在 5.0 mg/L 以上，系统内各水处理单元间差异不显著(P>0.05)。二级固定床生物净化池(SIW)养殖水体中的 NH4+-N 和 NO2–-N 质量浓度均显著低于一级固定床净化池(FMW)和养殖水池(PC)处理组(P<0.05)，其质量浓度分别在 0.85 和 0.21mg/L，FMW 与 PC 处理组水体中 NH4+-N 和 NO2–-N 的质量浓度差异不显著(P>0.05)。不同水处理单元的 NO3–-N、硅 (Si) 、 TN 、 总 磷 (TP) 的质量 浓 度 差 异 不 显 著(P>0.05)。结果表明，不同生物净化处理对降低 NH4+-N和 NO2–-N 质量浓度具有显著差异。
2.2 养殖系统菌群测序结果
经 16S rDNA 基因 V4 片段 Illumina MiSeq 测序并优化质控后，21 个微生物样本共得 1 296 349 条有效序列，平均每个样本 61 731 条，长度主要在 201~300 bp 之间，平均为 255 bp。基于 97%相似性水平划分 OTUs 的稀释曲线结果显示，每个样本测序深度超过 50 000 条 reads，且曲线趋于平缓，表明对虾工厂化养殖系统的微生物测序深度已接近实际菌群情况，满足下一步分析需求。
2.3 微生物丰富度和多样性分析
基于对虾工厂化养殖系统菌群 OTUs 绘制 Venn图，用于分析各组 OTU 的相关性。结果显示，所有的微生物样品中共鉴定出 8276 个 OTU，所有的样品共有的 OTU 为 183 个。生物净化载体样品(FMB、SIB)处理组中独有 OTU 数高于水体样品(FMW、SIW)，其中 SIB 处理组最高(P<0.05);对虾 LVT 处理组的独有 OTU 数量显著高于水体样品(FMW、SIW)(P<0.05)。为了评估不同处理间微生物群落的 α 多样性，分析了 Chao1、Shannon 和 Simpson 指数，结果显示，SIB 处理组的 Chao1 指数、Shannon 指数显著高于对虾 LVT 处理组的指数(P<0.05) 。
2.4 对虾循环水养殖系统菌群结构分析
所有微生物样品中共鉴定出 46 个细菌门，其中水体和虾肠道中的优势门不同。水体(FMW、SIW、PC)中优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)，生物净化载体中优势菌为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和浮霉菌门(Planctomycetes)，而对虾肠道优势菌为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门(Firmicutes)。
不同生物净化载体(FMB 和 SIB)中浮霉菌门以及硝化螺旋菌门的丰度显著高于其他处理组(P<0.05);对虾肠道(LVT)中变形菌门和厚壁菌门丰度显著高于水体和生物净化载体(P<0.05)，而放线菌门丰度显著低于水体和生物净化载体(P<0.05)。在已鉴定的 947 个属中，可以看出某些菌属丰度在水体、生物净化载体和对虾肠道中存在明显差异。
例如，弧菌属(Vibrio)在生物净化载体中丰度较低，而在水体(FMW、SIW)和肠道中丰度较高。从热图中可以看出，一级净化水体中的弧菌属的丰度高于二级净化水体，而二级净化水体高于养殖水体，浮霉菌属(Planctomyces)的丰度在生物净化载体样品中比在水体和虾肠道中要高，乳酸杆菌属(Lactobacillus)的丰度在对虾肠道的丰度最高，在水体中丰度最低，但在水体中含量极低。FMW、SIW、FMB 和 SIB 处理组中分枝杆菌属(Mycobacterium)的丰度均高于肠道，肠道中的短波单胞菌属(Brevundimonas)的丰度高于水体(FMW、SIW)和生物净化载体样品(FMB、SIB)中的丰度，LVT 处理组中潘多拉菌属(Pandoraea)和叶杆菌属(Phyllobacterium)的丰度高于水体和生物净化载体。
3 讨论
生物净化在对虾工厂化循环水养殖系统中具有重要的作用(徐如卫等, 2015)。本研究通过对比养殖水体和生物净化载体上的细菌群落结构组成发现，二者的细菌群落结构组成基本一致。目前，在人工水产养殖系统中，由于放养密度高，投喂的饲料和粪便造成水中有毒的氨氮和亚硝酸盐浓度上升，水体中的硝化细菌通过硝化作用可将氨转变为亚硝酸、将亚硝酸转变为硝酸，因此硝化细菌在循环水系统扮演着十分重要的角色(安晓宇, 2010)。
本研究的各级生物滤池中亚硝酸盐含量水平相差不大，其浓度无明显的积累现象，养殖系统氨氮和亚硝酸盐浓度相对较低，且均在凡纳滨对虾安全养殖范围内，循环水养殖系统中水质状况良好。微生物作为水生生态系统的重要组成部分，有助于保持水质的稳定和水生动物的健康状况(Raul et al,2003)。对虾对营养物质的消化吸收依赖于肠道微生物群的稳定性，其失衡将直接影响到投喂饲料的利用、水产养殖环境的污染增加等问题(郁维娜等, 2018)。
因此，了解虾类养殖生态系统的微生物特征，建立有效的微生物调控策略，对于对虾工厂化养殖具有重要的作用。本研究中发现变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是养殖水体样品和生物净化载体样品中共同的优势细菌门类，这与以前对竺山湾和湖泊水体的浮游细菌的研究结果一致(Eiler et al, 2004; Tamaki et al, 2005; 薛银刚等, 2018)，也与谭八梅等(2021)发现的辽宁长海刺参养殖池塘水体菌群同季节第一优势菌门均为变形菌门，次优势菌门为拟杆菌门相一致。
且变形菌门在肠道中的丰度高于在水体和生物净化载体中，变形菌门是一种多功能细菌，在废水中具有很高的丰度，能够去除氮和磷，降解有机物和减少化学需氧量(Cottrell et al, 2000; Klase et al, 2019)。本实验中，变形菌门在肠道中的丰度高于水体，生物净化载体中丰度最低;放线菌可降解有机物，包括淀粉、蛋白质等大分子，并产生抗生素等抗菌物质(Wexler, 2007;Zothanpuia et al, 2018)。
本研究中，水体中放线菌门丰度很高，而在对虾肠道内含量较低，有利于养殖水体有机物和氮的分解。拟杆菌门包括拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲三大类，其中拟杆菌纲主要存在于动物肠道和粪便中，可有效促进碳水化合物的代谢(Shin et al, 2015);而黄杆菌纲主要存在于水生环境中，鞘脂杆菌纲的重要类群为噬胞菌属(Cytophaga)，在海洋细菌中占有较大比例，可降解纤维素。本研究中，拟杆菌门在水体、生物净化载体和肠道中的丰度差别不明显，但可以看出在养殖水体中含量较高。
4 结论
生物净化在凡纳滨对虾循环水养殖系统中的应用可降低对虾循环水养殖系统中 NH4+-N 和 NO2–-N 质量浓度，有效调控养殖水体水质指标。水体、生物净化载体以及对虾体内的优势菌群不同，变形菌和拟杆菌在水体、生物净化载体和肠道中均占优势，而浮霉菌主要聚集于生物净化载体，厚壁菌主要定植在肠道中，放线菌主要存在于水中。不同养殖环境微生物种类分布特征可为对虾循环水养殖微生物资源开发和养殖水质调控提供理论依据。
参 考 文 献：
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作者：宫 晗 1,2 陈 萍 2① 秦 桢 2,3 刘 洋 2,4高 焕 1,2 李吉涛 2 李 健 2 朱建新 2
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