慢性感染伤口细菌检测的研究进展

　　摘要：慢性感染伤口是临床处治的重难点，细菌生物膜的影响一直是临床关注的重点。在一系列生物检测技术的支持下，临床可以对细菌生物膜加以识别，了解不同菌株特征，提高细菌生物膜检出率，明确感染伤口的病原菌，临床对于慢性感染伤口的研究重点也在于此。基于此，本文就慢性感染伤口细菌检测的研究进展做了综述，旨在帮助临床深入认识慢性感染伤口的细菌生物膜，探索有效的临床干预和用药方案。

　　关键词：慢性感染伤口;细菌生物膜;微生物检测技术

　　细菌感染是引起慢性感染伤口的一个重要危险因素，临床通过采集伤口标本，利用生物学检测技术来评估伤口创面的菌群分布情况，了解感染菌株的特征、形态。以往临床多通过传统的细菌和伤口分泌物病原体培养检测，这种方法可准确诊断急性感染伤口，但对于慢性感染伤口的检测效果不佳，细菌培养率一直保持在1%~2%的低值区间[1];对于包括压疮在内的慢性创面有效菌属的培养大约为十二种，另外其阴性培养结果往往不符合明显感染症状以及体征表现，严重干扰临床治疗。

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　　而分子测序技术对于压疮等慢性创面的检测效果较好，可检出菌属种类106种[2]。导致慢性伤口细菌培养效果不佳的原因较多，例如取材方式、检测手段、标本采集部位以及培养时间等等，而且细菌以一种特殊形式——细菌生物膜存在导致慢性伤口感染加重，并逐步进展为难治性病灶。细菌生物膜导致伤口感染迁延不愈，顽固反复，而且伤口分泌物阳性培养率较低。研究表明，压疮、糖尿病足溃疡以及下肢静脉溃疡等慢性伤口上容易出现细菌生物膜，是引起伤口疼痛的主要原因，同时也对伤口愈合造成严重影响[3]。基于此，本文就慢性感染伤口细菌检测的研究进展做了如下综述，希望有所帮助。

　　1、慢性伤口渗液和组织特点分析

　　急性感染伤口渗液酸碱值一般在4~10，生长因子表达水平较高，炎性因子表达水平偏低;而慢性伤口渗液酸碱值一般在5.5~8.7之间，其成分主要为大量黏附因子、弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶、细菌以及免疫活性细胞，另外还有少量蛋白酶、电解质、细胞素、葡萄糖以及生长因子[4]。细菌分泌内毒素刺激炎性细胞因子表达水平不断升高，进而提高MMPs水平并引起抑制素失衡表现，抑制微血管生成，导致生长因子表达水平降低，细胞代谢迟缓，同时衰老细胞开始大量增多。细菌在慢性伤口中感染后以生物膜形式存在，并在伤口创面上依附生长，感染宿主细胞并对细胞信号传递系统产生干扰，引起修复细胞凋亡、自溶，最终导致局部组织坏死[5]。

　　2、慢性伤口感染样本的采集规范及培养方法

　　早期研究表明，伤口渗液标本中菌落计数水平较伤口组织更高。一项国内研究[6]认为，为保证致病菌培养质量，避免采样时意外混入定植菌群，建议采样前先准备无菌生理盐水，对伤口进行充分的冲洗，将伤口表面坏死组织、渗出物、碎屑以及脓液等成分予以清除，尽量采用抽吸取样的方法或者将采样拭子深入伤口内部，至基底部或者紧贴脓肿壁开始取样。取样手法一般为“十”字或者“Z”字，完成取样后常温保存，并在2h内送检培养。

　　脓液以及伤口分泌物的培养基一般为血琼脂平板、麦康凯平板以及巧克力平板分离培养基，分三区划线，巧克力平板置于5%~10% C02孵箱培养，温度为35°±1℃，经过18~24h培养后对菌落形态特征、大小、溶血情况、颜色以及气味进行观察。并与标本涂片染色结果进行对比，鉴定生长菌，同时评估菌落特征生化反应以及染色情况，开展药敏试验。对于抗菌药物敏感试验，其判定通常包括“敏感”、“中介”以及“耐药”三个等级，其中“敏感”提示药物可能有效，“中介”提示可能有效或失败，“耐药”提示可能失败[7]。对于非脓性标本，检验人员应提前准备增菌肉汤培养，然后接种培养基。即便如此，关于慢性伤口检测中传统培养方法阳性率偏低的报道依然居多。有观点指出，如果伤口存在窦道的情况下，可通过手术切除以及穿刺抽吸等途径对深部伤口进行取材。

　　一项关于小鼠慢性伤口模型的实验中，研究者将伤口组织切片取样并在4%甲醛液中保存，然后用石蜡油固定并制备为薄切片，经过HE染色和特殊处理，用玻片覆盖样本并逐一检测。有学者为了观察慢性伤口菌群的分布及特征表现，将内层和外层伤口敷料作为检测样本取材，然后进行无菌和密封处理并冷藏保存，由实验室人员进行检测：将渗液浸透的敷料剪切成方形，面积为5cm x5cm，然后通过伤口液洗脱以及温度控制培养制取获得标本[8]。文献报道指出伤口清洗完毕后可以用生理盐水棉签对伤口组织进行擦拭和采集，但应确保样本量充足，防止病原菌在转运过程中因干燥而凋亡。取样操作时棉签头部应确保被渗液完全覆盖并染色[9]。

　　总的来说，人工标本采集可能会对细菌培养结果造成影响，导致阳性率偏低，但并非唯一因素;导致细菌阳性率不高的因素还有实验室培养技术、方法以及微生物检测技术等等

　　[5]。除此之外，创伤出血性伤口、12h以内的烧伤创面和敷药后未超过4h的伤口均不建议采集样本，此种情况下所取样本培养阳性率偏低[10]。

　　3、微生物检测技术

　　随着检测技术和检测设备的不断发展完善，临床开始探索慢性感染伤口的检测新技术，以确保微生物检出率。常见的检测技术有聚合酶链反应(PCP )、荧光原位杂交技术(FISH)以及分子检测技术等等[11]。研究表明，采用常规细菌培养方法对伤口表面采集拭子进行检测，超过70%的患者致病菌以假单胞菌以及金葡菌为主，而通过分子技术对同样方法采集的伤口拭子标本进行检测，结果表明所检出致病菌菌株为10种左右，其病原菌检出率高出常规检测方法约4倍[12]。另有研究通过FISH技术对慢性伤口小鼠模型进行检测，通过对12d组织切片的检测发现，同种类细菌呈带状分布，并且大多在伤口边缘集中;一项研究观察了确认存在有生物膜的慢性感染伤口，利用FISH技术检测表明绿脓杆菌数量和常规细菌培养检测所得结果也存在很大差异[13]。所以通过特异性微生物检测技术对慢性伤口进行检测，明确致病菌分布情况以及细菌聚集特点是支持慢性感染伤口临床诊断的重要手段，便于临床明确感染病原菌并开展针对性治疗[14]。

　　4、慢性伤口感染和细菌培养关系

　　在细菌培养检测中，细菌生物膜阳性检出率不高是现阶段的客观事实[15]。一些观点认为细菌生物膜外层胞外多糖基质对抗生素的进入产生了延缓或阻碍作用，而生物膜内各部分化学微环境有明显的区域性特点，从外到内生物膜的酸碱度、渗透压、氧气浓度以及营养物质浓度存在梯度变化，细胞膜深层细菌虽然保持静止休眠，但依然处于存活状态，这可能是导致生物膜细菌培养阴性结果以及耐药性的一个重要原因[16]。

　　有观点指出，生物膜外层胞外多糖基质对于机体抗体以及免疫细胞也产生了明显的限制，导致其难以进入，进而削弱组织抗菌能力，同时向外释放抗原，对机体产生刺激并形成大量特异性抗体，这些抗体受到胞外多糖基质屏障效应的影响而无法进入生物膜，反而形成免疫复合物对周围组织产生损伤，最终导致慢性感染持续性加重[17]。

　　另有研究[18]认为，人体感染中存在厌氧菌的病例几乎接近100%，然而在大部分细菌性感染中，厌氧菌感染恰恰是最容易忽视的那一种，因为目前国内外尚未大规模推动厌氧菌检测技术的应用，采用常规方法进行厌氧菌培养时容易误判为无菌性炎症。一项研究以骨伤患者为研究对象，通过需氧培养技术对其伤处标本进行检测，结果显示44%的标本为“无菌生长”。对于慢性伤口标本的检测，临床发现在需氧菌制造的低氧环境下，厌氧菌的存活率提升，存活时间延长，致病力也随之增加[19]。另外，对于细菌培养结果为阴性但明显出现感染症状的伤口，临床也应警惕厌氧菌感染的危险[20]。

　　5、体会

　　近年来随着各类广谱抗菌药物的大量应用以及细菌生物膜的形成，细菌耐药问题以及抗宿主免疫反应不断加重，抗菌敷料和药物难以取得应有的效果，慢性感染伤口因此成为困扰临床的难题。常规细菌培养技术几乎无助于慢性感染伤口的临床诊断，除了需要持续更替现有检测技术并加以完善外，我们还应对不同慢性伤口中不同感染菌群的差异有充分考虑。其次应充分清洗伤口，确保创面始终保持清洁，抑制细菌数量以及菌群定植几率，以控制感染。这些操作也符合彻底清创并清洗后确保抗菌敷料发挥作用的观点。另外，考虑到生物膜细菌具有多层存在的特点，而深层细菌具有更强的抵抗能力，传统微生物检查仅能完成细菌定型，或检测潜在病原体对于各类抗生素的药物敏感性，因此临床多采用经验性用药方案开展抗菌治疗，而抗菌药物敏感试验指导临床抗菌治疗时，需要经验性治疗结束后24~48h时才能得出结果，而在经验性治疗后72h内应结合临床疗效以及抗菌药物敏感试验对经验性治疗方案展开重新评估，倘若疗效不佳，抗菌药物敏感试验提示“耐药”，则应调整用药方案。

　　参考文献：

　　[1]张雪艳.基因芯片法对细菌性痢疾患者黏液脓血便病原菌检测阳性率的影响[J].内蒙古医学杂志,2020,52(09):1031-1032.

　　[2]程燕.伤口分泌物细菌培养及药敏试验对慢性化脓性骨髓炎患者抗菌药物合理使用的影响[J].河南医学研究,2019,28(19):3597-3599.

　　[3]蒋琪霞,王建东,彭青, 等.负压伤口治疗结合纳米银敷料处理创伤性慢性伤口的效果比较[J].医学研究生学报,2019,32(11):1198-1202.

　　[4]武洁,王荃.病原微生物检测在感染判定的意义[J].中国小儿急救医学,2020(03):175-176-177-178-179-180.

　　[5]刘伯让,毕晓洁,王勤, 等.慢性化脓性骨髓炎伤口分泌物细菌学特征与耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2016,26(2):382-384.

　　[6]胡海洋,陈明刚,杨业永,张雪芹.微生物形态学检验用于感染性疾病诊断的应用价值[J].中国医药科学,2020,10(01):224-226+251.

　　作者：朱珊珊

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