合成生物学在农残检测领域的应用

　　摘要：近年来，合成生物学在多个领域崭露头角，在农残检测中也发挥越来越重要的作用。基于合成生物学模块化和工程化指导思想，各种基因部件的多样化组合为农残检测提供更多方案。简便、耐用、低成本、原位检测等特点也使其较传统检测手段具有更强的竞争力。但与此同时，合成生物学在农残检测中的应用也受到复杂检测环境和生物安全性等问题的影响。结合目前合成生物学在有机氯、有机磷、拟除虫菊酯和氨基酸甲酯类农药检测中的应用与创新实例，归纳合成生物学在农残检测中应用的原理，分析并探讨合成生物学技术未来在农残检测中的发展潜力与应用前景。

　　关键词：合成生物学;农残检测;生物反应器;酶;生物技术

　　二十世纪中叶以来，随着化学品生产工艺的革新，廉价高效的农药逐渐成为现代农业生产中的“必需品”。世界每公顷耕地面积的农药使用量(kg/ha)从1990年至2017年增长了70%[1]。在全球范围内，每年农药的使用量接近30亿公斤，商品估值约为400亿美元[2]，这些数据表明农药的市场十分庞大并不断扩张。虽然农药的使用有效地避免了农作物的病虫害，提高了产量，但随着农药的使用范围不断扩大，其对于环境的污染和动植物的危害也显露出来，直接威胁着人类的健康。

　　化学合成农药是应用最广泛、毒副作用最显著的一类农药，包括有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类等[2]。这类农药化学性质稳定、半衰期长并且能够在自然界长期存在并蓄积[3]，从而引起环境污染。据研究报道，在地下水、地表水[4]、土壤[5]、空气[6]和高海拔地区[7]都能检测到这类农药。化学合成农药还表现出广泛的毒性，有机磷农药和有机氯农药具有强的神经、消化、内分泌、生殖系统等[8-15]毒性。拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类杀虫剂虽然毒性较小，但也被报道能够增加多种疾病的患病风险[16-18]。

　　农药残留对人类的健康造成了极大的威胁，对其进行有效检测成为保障人类健康安全的重要环节。但常规的检测手段操作复杂、等待时间长、检测成本昂贵[19]，无法满足农残原位检测的需要。因此开发灵敏度高、特异性好、耐用性强的便携快速检测方法对微量甚至是痕量的农残进行有效监控已成为农药检测研究领域的热点及难点之一。合成生物学作为一门新兴科学，通过基因编辑手段和工程化思维对生物体进行改造与创新，常被称作变革性的工具。

　　其独特的创造性近几十年来给多个领域和行业带来了新的生机与活力。以环境修复领域为例，利用合成生物学改造出的菌株能够有效检测和降解多种环境污染物[20-22]，其中包括对农药残留的检测。合成生物学能够将传统的生物传感器、农残诱导操纵子等响应部件和输出不同信号的报告系统进行多样化组合，激发传统生物检测技术的新潜能，为多种农残的检测提供新的思路与方法。原位检测农残的特点更是传统检测手段无法比拟的，高灵敏度和多输出信号也打破了农残检测的固有局限，拓宽了检测的应用范围。对比传统的检测手段，本文归纳与总结当前合成生物学技术在农残检测领域的应用与创新，分析其具有的优势与挑战。

　　1传统检测方法

　　目前检测农药残留的传统方法大致可分为两类：一类是以色谱法、质谱法、光谱法以及酶联免疫吸附(ELISA)等方法为代表的常规方法。这些方法能够提供可靠的分析结果。但操作费时、预处理复杂、成本昂贵且需要使用大量的有机溶剂，因此不适用于针对大量样品的检测工作[23]。另一类则是基于各种生物传感器等先进检测方法，操作简单、检测成本低且适合现场检测，但高昂的开发成本限制了其在现阶段的应用。

　　1.1传统的波谱检测技术

　　1.1.1气相色谱法

　　气相色谱(GC)适用于分析非极性、易挥发且易汽化的化合物。其通常与特定的检测器结合用于不同农药检测，表现出了优异的性能[24]，如电子捕获检测器(ECD)适用于检测卤代化合物，火焰光度检测器(FPD)主要用于测定含硫和磷的农药化合物，氮磷检测器(NPD)对含有氮和磷的农药有极高的选择性，而火焰离子化检测器(FID)则几乎适用于各种农药的检测[25]。

　　1.2酶联免疫吸附法

　　酶联免疫吸附(ELISA)法因其低成本、操作简单等优点而被格外重视。该方法基于抗原-抗体间的特异性相互作用，因此能为某些农药提供特异性极高的检测结果。同时，该方法能够一次性装载大量样品，极大地简化了样品的处理程序[27]。单链抗体(scFvs)和纳米抗体(VHHs)等小抗体与特定蛋白进行融合产生的新型酶联免疫吸附方法也开始出现[28,29]，常见的设计为抗体-碱性磷酸酯酶(AP)融合体。

　　这种融合表达设计能够省去二抗的步骤，是一种简单快速的竞争性酶联免疫吸附测定方法。该法已被应用于拟除虫菊酯类农药[28,30,31]、有机磷类农药[32-34]的检测。但该技术特异性较差，对于特定农药检测的专一性不够强，无法胜任未知样品的农残检测[35]。

　　1.3毛细管电泳法毛细管电泳法(CE)对样品量要求较低、分离效率高且耗时短。但毛细管内径较小，在检测中只允许少量进样，因此在灵敏度方面有一定的欠缺，一般与高灵敏度的检测方法(如MS)联用以弥补不足[36]，或者通过更高效的样品浓缩方法来提高检测的灵敏度[37]。该方法与色谱法及ELISA相比，进一步提高了检测效率并降低了成本。

　　1.4表面增强拉曼光谱法表面增强拉曼光谱(SERS)法具有快速测定食品中农药残留的能力，其灵敏度极高且操作方便。目前已经开发出多种SERS检测方法：原位SERS方法，可直接检测植物表面的农药残留[38,39];以纳米银粒子为基质的SERS方法无需样品处理即可检测饮料样品[40];结合表面拭子的SERS方法可对水果表面残留的农药进行检测[41]。但使用该方法需建立不同农药分子的光谱数据库，并对农药的代谢物、转化产物等进行光谱学的研究。

　　1.5传统的无细胞生物传感器法传统的无细胞生物传感器基于配体-受体特异性结合的原理，将待检测物的含量、种类等信息通过不同的方法转化为各种信号，从而达到定量检测的目的[42-47]。这类方法与前述的方法相比集成度高、简单便携且不依赖于精密仪器。

　　2应用于农残检测的合成生物学

　　近年来合成生物学模块化、工程化思想逐渐应用于农残检测领域，本节将结合目前合成生物学在农残检测领域的应用，对其应用原理进行介绍。

　　2.1全细胞生物传感器

　　合成生物学技术可以在细菌体内构建模块化基因回路并建立起能够检测特定类型农药的全细胞生物传感器。生物传感器的构建不再需要纯化蛋白的复杂步骤，而是将整个细胞作为检测器，大大节省了时间和成本。

　　2.1.1表面展示水解酶

　　当前研究已报道了多种能够降解特定农残的酶，如有机磷水解酶(OPH)[48]、甲基对硫磷水解酶(MPH)[49,50]、γ-六氯环己烷脱氢氯酶[51]等。这些酶能够将农残降解为更易于检测的小分子或特征化合物，通过检测降解产物可以间接测定农残含量。

　　这些酶的发现及其基因鉴定是合成生物学的改造基础。农残降解酶通常存在于土壤微生物体内，但这些微生物往往繁殖能力弱、对生长环境要求高、产酶效率低，不适合作为全细胞生物传感器的底盘细胞。合成生物学技术将原始宿主菌体内的降解途径转移到易于进行基因操作的细菌体内，成功构建出高效的农残检测工程菌株[51]。同时为了避免农药低效的跨膜转运及转运的损失，常通过表面展示系统将降解酶表达在菌体表面，利用体外催化的方式实现对农残的降解与检测[52-54]。除催化型的生物传感器外，近些年利用重组基因技术在菌体表面展示抗体的农残检测方法也开始出现[55]。

　　2.2无细胞合成生物学

　　无细胞合成生物学指的是构造的工程化回路在无细胞底盘的类细胞系统中(含有细胞表达的必需成分)进行转录与表达[60]，其能精准控制各组分的混合比例，与简单的数学建模相结合，检测更加准确。无细胞合成生物学的出现，规避了基因修饰微生物(GeneticallyModifiedOrganisms,GMOs)的释放，避免了生物安全性问题[61]，使得合成生物学应用于农残的现场检测更为安全，更具实用性。

　　3合成生物学在农残检测中的应用

　　3.1合成生物学应用于有机氯农药的检测

　　有机氯农药(OCs)是一类半衰期长的合成有机化合物，常见的有机氯农药有二氯二苯基三氯乙烷(DDT)，林丹(γ-HCH)，阿特拉津，β-六氯环己烷(β-HCH)等。由于使用广泛和半衰期较长，OCs已成为环境中普遍存在的污染物[63]。对于有机氯农药，目前的主要检测方法是气相色谱-质谱法、固相萃取色谱法等复杂精细的方法，这些方法费时又昂贵，不适于现场检测。近些年来针对此类农药，已经开发出一些极具潜力的合成生物学检测方法。

　　3.1.1代谢矿化作用

　　检测有机氯农药的主要思路是将难以直接检测的有机物初步代谢为易于检测的化合物。研究表明γ-六氯环己烷氯化氢酶通过三步脱氯作用，可初步降解林丹γ-HCH，并释放三个HCl分子。聚苯胺的质子化程度及其电导率随pH的降低而增加，将HCH脱氯化氢酶(LinA2)基因导入大肠杆菌中表达，并将工程菌固定在可检测pH变化的聚苯胺基质中，施加0.4V电势时，电流可随pH的降低(HCl分子的产生)而增加，因而构建出高灵敏度、选择性强的林丹(γ-HCH)全细胞传感器[51]。

　　4结语

　　合成生物学作为一门新兴学科，在短短十多年间已经取得了众多突破性的进展。目前研究者们已经构建了大量在实验室范围内可用的全细胞生物传感器，也开发了一些更具实际应用优势的无细胞合成生物学检测方法，在多种农药的特异性检测方面取得一定的研究成果。这些传感器大多通过设计巧妙的特异性响应，使得在特定农药分子存在时出现易于监测的阳性信号，大大方便了农残检测[20]。

　　相比传统方法，这些新方案存在诸多优势，其不需要大而昂贵的精密仪器，也不需要复杂的运输和前处理过程，更加具有现场检测、原位监测的潜力，在商业化上也更有成本优势。但是，合成生物学在在农药检测中的应用尤其是全细胞传感器仍然面临着众多挑战。全细胞生物传感器一般无法达到化学检测的精度，而且在很多情况下由于报告基因的表达所需的时间而造成延长响应，此外如何在营养缺乏甚至是含毒性化合物的环境下保存细胞活力也是必须考虑的问题[88]。

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　　针对上述问题，研究人员试图通过精制宿主植株[89]、设计更敏感的启动子[90]、使用表面展示的蛋白[91]等提高微生物传感器的特异性、敏感性并减少响应时间[92]。选择水凝胶[93]等材料进行封装，提升安全性同时方便储存。近年来各种各样的合成生物学检测方案正在进行从实验室走向实际推广应用的尝试。一方面这需要克服前文提到的检测限、特异性和培养条件等限制，另一方面也必须考虑生物安全问题。这不仅要求研究人员加强生物控制，也要求在应用前对微生物衍生传感器对生态环境和人类健康的潜在影响进行更系统的评估[88]。在未来，微生物传感器也将向着更自动化、更精细的无细胞系统发展，具有广大的前景[89]，合成生物学势必在其中起到关键性的作用。

　　参考文献

　　[1]TheFAOCorporateDatabase,FAOSTAT.agri-environmentalindicators/pesticides[EB/OL].FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations2019[2020-12-20]. http://www.fao.org/faostat/en/#data/EP.

　　[2]SharmaA,ShuklaA,AttriK,etal.Globaltrendsinpesticides:aloomingthreatandviablealternatives[J].EcotoxicologyandEnvironmentalSafety,2020,201:110812.

　　[3]KhanMA,AhmadW.MicrobesforSustainableInsectPestManagement:anEco-FriendlyApproach[M].Cham:Springer,2019:2-6.

　　[4]HuntschaS,SingerH,CanonicaS,etal.InputdynamicsandfateinsurfacewateroftheherbicidemetolachlorandofitshighlymobiletransformationproductmetolachlorESA[J].EnvironmentalScience&Technology,2008,42(15):5507-5513.

　　作者：毛金竹1,3，肖淑玲1,2，杨智淳1,2，王孝宇1,4，张诗1,5，陈俊宏1,2，谢佶晟1,2，陈福德1,2，黄子诺1,2，冯天宇1,2，张瑷珲1,2,6，方柏山

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