生物正交反应及其在药学中的研究进展

　　摘要:最近二十年见证了生物正交反应在生物体系中尤其是在活体中的广泛应用.由于其高度的专一性、较高的反应速率和良好的生物兼容性,生物正交反应为化学生物学的发展和研究生命进程带来了革命性的技术方法.本文首先简要介绍金属催化的偶极环加成反应、叠氮-烷烃的环化加成反应、逆电子需求的狄尔斯-阿尔德环加成反应和光催化的生物正交反应;然后总结了其在药物化学中的研究进展,包括该反应在药物靶点验证和活性分子结构发现等方向的研究概况;最后在此基础上对该技术在药物化学中的挑战和未来发展进行了展望.

　　关键词:生物正交反应; 药物化学; 蛋白质标记; 活体应用; 定点修饰

　　生物正交 反 应 (Bioorthogonalreaction)是 一 类能够在生物体环境系中尤其是在活体动物内进行、且不与 周 围 其 它 生 物 化 学 过 程 相 互 干 扰 的 化 学 反应[1-2].由于生物体系的复杂性,具有高度专一性和快速反应能力的生物正交反应是化学生物学领域的重要前沿,为科学家们研究生命进程带来了革命性的技术方法,对生物体系的标记和功能调控有着重要应用.生物正交反应通过化学和生物反应来选择性地高效修饰报告基团在靶标上。

　　其主要反应类型包括初期K.B.Sharpless和 M.Meldal教授发现的铜催化的叠氮和末端炔基之间的1,3-偶极环加成反应(coppercatalyzedazide-alkynecycloaddition,CuAAC),以及Bertozzi教授等改进的环张力型炔烃参与的无金属催化 剂 使 用 的 环 加 成 反 应 (strain-promotedazidealkynecycloaddition,SPAAC).研究者们后来发现带有环张力的烯烃也可以发生类似的环加成反应,尤其当采用四嗪和反式环辛烯时,由于受环辛烯环内张力释放和生成气态副产物的双重驱动作用,该逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(inverse-electron-demandDielsAlder,IEDDA)反应的反应速率远大于之前的反应,并能够用于活体成像等体内生物标记反应.除反式环辛烯外,环丙烯、降冰片烯、氮杂环丁烯等具有张力的小环烯烃也可与四嗪快速反应.这些革命性的化学技术极大地促进了化学生物学这个新兴交叉领域的发展.

　　2000年,Bertozzi课题组开发出能够用于化学修饰细胞表面的Staudinger偶联反应,逐渐开启了生物标记领域的研究热潮.经过20年的发展,由于具有特异性位点标记的优点[2],生物正交反应已被研究人员广泛使 用 在 复 杂 生 物 体 系 中 标 记、分 离 和 研 究 蛋白[2]、糖类[3]、脂类[4-5]等不易或者不能通过基因方式修饰的生物活性分子,在活细胞成像、疾病诊断和生物组学分析中发挥了重要的作用.我国的研究者也在该领域做出了杰出的贡献[6-7],也综述介绍了生物正交反应的原理和研究现状.陈鹏等课题组在生物正交反应[8-9]、位点特异性标记蛋白[10]及其生物正交剪切反应(bioorthogonalcleavagereactions,BCRs)[11]等方面分别总结了该领域的进展,该课题组也综述报道了生物正交反应在我国的研究进展[12].围绕IEDDA剪切反应在生物正交化学领域的发展与生物学研究中的应用尤其是生物成像也有很好的综述报道[13].

　　近年来,生物正交反应在生物医药研究中也有广泛的应用前景.本文首先简要介绍生物正交反应的主要类型;然后总结其在药物化学中的研究进展,包括该反应在药物靶点验证和药物活性分子骨架发现等方向的研究进展;最后在此基础上对该领域在药物化学发展中的挑战和未来发展方向进行了展望.

　　1 金属催化的生物正交反应

　　1.1 铜(Cu)催化的生物正交反应生物正交反应的最显著要求之一是反应具有较高的反应速率,而之前发现的大部分反应都难以满足这个条件.一价铜离子催化的叠氮化合物与含有末端炔烃 的 环 加 成 反 应 CuAAC 即 “点 击 化 学 (clickchemistry)”是发现最早、研究最多的生物正交反应之一.

　　叠氮化合物与炔基之间的环加成反应最早是由Huisgen于1963年发现的,但是该环加成反应条件苛刻,且 反 应 速 率 较 慢,而 K.B.Sharpless 和 M.Meldal两位教授于 2002 年发现一价铜离子能够显著加快叠氮化合物和炔基之间的环加成反应,该反应条件温和,只要在室温条件下即可进行,且反应速率大大加快,约为之前的一百万倍[14-15].将化学反应应用到生物体中首先必须要考其虑毒性问题,而前文提到的在生物正交反应中起催化作用的一价铜离子能够参与产生对生物体系有毒的活性自由基,严重影响一价铜离子催化的反应应用.

　　为了解决这一问题,研究者们发现,加入配体与铜离子形成配合物能够有效地降低毒性,也可增加该一价铜的稳定性并加快反应速率,这种优化方式被称作由配体辅助的 CuAAC.目前已知的配体有寡聚三氮唑类化合物 TBTA[16]和水溶性较好的 THPTA[17],以及其它 TBTA 的水溶性类似物(如 BTTAA、BTTES、BTTP和 BTTPS)[11,18],天然氨基酸组氨酸也可有效辅助 CuAAC反应且几乎无细胞毒性.除了通过配体螯合铜离子来降低生物毒性、提升反应速率之外,对 CuAAC的反应底物进行特定的修饰也能够使反应速率进一步加快.一种常用的方法是在叠氮基的邻位用吡啶来修饰(如叠氮基甲基吡啶),叠氮化合物中的吡啶能够与铜离子螯合,从而使铜离子更快地参与反应[19].Wu等发现,当吡啶上含有供电子基团时,能进一步加快反应的速率[20].除了 CuAAC偶联反应之外,铜催化的生物正交剪切反应也被报道[21].

　　陈鹏等发展了“双取代炔丙基/铜试剂”,通过炔丙基的剪切调控,实现了非天然氨基酸定点插入的细胞膜表面受体-配体相互作用的原位调控[22].这种策略也可拓展至基于氨基或者酚羟基的 ADCs,这种分子内剪切反应可以实现选择性杀伤癌细胞.

　　1.2 钯(Pb)催化的生物正交反应钯作为有机合成中常用的高效催化剂,在生物正交反应中也拥有巨大的应用潜力.钯催化的蛋白质和小分子的偶联反应在初期并不理想,直到 2009 年,Davis课题组开发了一种水溶性配体—ADHP(2-氨基-4,6-二羟基嘧啶)[23].ADHP 与醋酸钯共存时能够高效地催化带有碘苯基的蛋白质与多种苯硼酸类化合物的 Suzuki-Miyaura反应.

　　两年后,Lin课题组对 ADHP进行了结构优化,发现 N,N’-二甲基化的DADHP能够和醋酸钯在细菌体内实现 Sonogashira偶联反应以标记蛋白质[24].随着对钯催化生物正交反应研究的不断深入,研究者发现即使不使用配体也能用钯高效地催化生物正交反应.陈鹏课题组设计了一种无需钯催化的 Sonogashira偶联反应,能够对活细胞内位点特异的蛋白质进行标记.该课题组发现用 PEG 链来连接染料和反应基团时,只需要硝酸钯即可实现对大肠杆菌内蛋白质的 Sonogashira偶联标记细菌,不但效率高,而且没有细胞毒性[25].

　　曲晓刚课题组开发出了一种能够被光调控的纳米钯催化剂(如图3所示),这种催化剂中的钯被负载在由偶氮苯和β-环糊精的超分子复合物修饰的大孔二氧化硅中,在光照条件下偶氮苯的构型发生变化从而诱导β-环糊精分子的解离从而恢复钯的催化活性,实现了细胞内的 Suzuki-Miyaura偶联反应[26].

　　生物正交反应除了常见的偶联反应外,还有生物正交剪切反应,而钯催化的生物正交剪切反应也有着广阔的应用前景.钯介导的炔丙基/烯丙氧羰基的脱除反应是生物正交剪切反应中应用最多的反应之一(如图4所示).陈鹏课题组在2014年首次报道了该类钯催化的剪切反应,在活细胞内利用钯催化脱除了炔丙基,完成了赖氨酸的“化学脱笼”,以此实现了细胞内蛋白质的原位激活[27].该课题组还将这类方法应用于酪氨酸依赖的蛋白质功能原位调控方法[28].

　　2 无需金属催化的生物正交反应

　　2.1 环张力诱导的环加成反应(strainpromotedcycloadditionreaction)金属催化的叠氮和末端炔基之间的环加成反应是使用最为广泛的生物正交反应,由于金属离子会产生细胞毒性,研究者们通过对炔基底物进行结构改变开发出了不需要铜离子催化的叠氮-炔基[3+2]环加成反应(strainpromotedazide-alkynecycloaddition,SPAAC).

　　早在2004年,Bertozzi课题组使用八元环炔基作为 底 物 与 修 饰 在 细 胞 表 面 的 叠 氮 基 团 进 行SPAAC反应,没有发现明显的细胞毒性,但是其与叠氮化合物反应的速率较低[39].为了提高该反应效率,Bertozzi,Boons等研究者们在八元环上进行结构优化[40-42],发现了更多反应速率快的环辛炔的衍生物[43-44],其中最快的二级反应速率达到了4.0M-1·s-1.最近,Franzini课题组系统综述了包括SPAAC在内的无需金属催化的生物正交反应的机理和取代基的反应,预期对该领域将起到很好的总结和启发作用[45].

　　硝酮也可以替换叠氮作为一种活性基团参与叠氮-硝酮环加成反应(strain-promotedalkyne-nitronecycloaddition,SPANC),其反应速率比相同条件下的SPAAC反应要快30多倍[46].Pezacki课题组发现环状硝酮与八元环炔的SPAAC的反应更快,并成功地实现对细胞表面蛋白质的特异性染料标记[47].

　　2.2 逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应(IEDDA)传统有机化学中,狄尔斯-阿尔德(DA)反应是指发生在富电子双烯体和缺电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应.与之相反,发生在缺电子双烯体和富电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应被称为逆电子需 求 的 狄 尔 斯-阿 尔 德 反 应 (inverseelectrondemandDiels-Alderreaction,IEDDA).反应生成的中间体具有高度环张力,会迅速脱去一分子氮气,最终生成六元环哒嗪分子(如图9所示)[48].这种反应不需催化剂和外源能量驱动就能直接发生特异性偶联反应,且具有生物兼容性好、反应专一性高和反应速率快的优点,这使得该反应成为最受关注的生物正交化学反应.

　　2008年,Fox研究组和 Hilderbrand课题组分别独立 报 道 了 这 类 IEDDA 反 应 在 生 物 体 系 中 的 应用[49-50].此后,研究者们发展了不同的环式烯烃和四嗪分子衍生物(如图10所示)[51-52],将IEDDA 反应成功应用与荧光物质的“增强(turnon)”和蛋白的定点修饰中.

　　传统方法集中在高度对称的四嗪衍生物,该领域的研究者发现四嗪的3,6位链接吸电子基团时反应效率较高,但是随着深入研究,发现3位和6位的连接基团的选择极为复杂.陈鹏课题组设计了不对称四嗪衍生物,结果表明在3位连接吸电子基团,在6位连接非吸电子基团能够使反应活性与分子稳定性达到最佳平衡,成功地实现了活细胞内的快速生物正交反应[53].此外,Weissleder研究者发现四嗪所连接的酸性基团也会影响反应速率,并提出了“局部酸催化理论”[54].结果表明,在形成双环中间体之后,3位或6位的酸性基团会参与到下一步的异构化反应之中,动力学上利于发生后续消除反应,且基团的酸性越强,反应速率越快.

　　3 光催化的生物正交反应

　　相较于金属催化的生物正交反应,光介导的反应由于其利用外源光的便捷性和可控性,在时间分辨等方面具有天然的优势,近年来得到了广泛的关注.

　　3.1 紫外光催化的1,3-偶极环加成反应1,3-偶极环加成反应在无金属催化下也得以成功实现.由于二芳基取代的悉尼酮在紫外光的照射下会快速生成高活性的1,3-偶极中间体,与烯烃发生[3+2]环加成反应,余志鹏课题组通筛选出了高活性二芳基取代悉尼酮,与不同烯烃、炔烃进行组合,构建了多种生物正交偶联反应类型,从而实现对生物体系中不同多肽和蛋白质的选择性标记[70].

　　四氮唑在被紫外光照射之后生成的活泼1,3-偶极子,与烯烃快速发生环加成反应,是光点击化学反应的代表性反应之一.荧光化合物被四氮唑修饰之后通常会处于淬灭状态,而当四氮唑与烯烃发生环加成反应之后会恢复荧光.利用这一原理可对特定的蛋白质进行标记.在大肠杆菌与哺乳细胞 HEK293的蛋白中定点插入了含有双键的人工合成非天然氨基酸,然后加入四氮唑修饰的无荧光染料进入细胞.

　　Lin等发现在365nm 的紫外光照射下,染料在大肠杆菌与 HEK293细胞中均恢复相应的荧光,这得益于四氮唑与非天然氨基酸的双键在细胞中的快速环加成反应[71].该课题组还开发了带有含有双环烯烃的效率更高的反应,其二级速率常数高达(1850±218)L·mol-1·s-1,可以更有效定点标记绿色荧光蛋白[72].

　　4 生物正交反应在药学研究中的应用

　　4.1 生物正交反应在活性药物分子发现中的应用在生物体内,小分子在特定作用器官或病灶位点的原位自组装是一种发现药物活性分子的极具优势的潜在方法[79].利用生物正交反应尤其是叠氮和末端炔基之间的环加成反应把两个药物片段原位连接,可用于设计靶点蛋白的抑制剂(如图18所示)[80].利用这种方法,研究者们通过库筛选的方法获得了活性较好的乙酰胆碱酯酶、碳酸酐酶等酶抑制剂[81].

　　作为生物正交反应中反应速率最快的反应,逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(IEDDA)反应可在细胞中用于发现活性药物分子[82],AstexPharmaceutical公司的研究表明,四嗪和反式环辛烯介导的反应可以在活细胞中 将 BRD4 或 ERK1/2 抑 制 剂 与 E3 连 接 酶CRBN 的配体thalidomide连接起来(如图19所示),能够快速优化连接方式得到活性很好的 PROTACs分子[83].

　　4.2 生物正交反应在靶向药物递送和前药设计与激活中的应用除了在细胞中筛选活性分子之外,生物正交反应在疾病的靶向药物递送尤其是在活体中前药的递送和激活中有着广泛的应用,这主要得益于生物正交剪切反 应 或 者 click-to-release 反 应 的 发 展.2014 年Bradley和 Uniciti-Broceta等首次利用具有生物相容性的零价钯树脂在斑马鱼的胚胎卵黄囊中催化剪切释放出荧 光 探 针[84]。

　　这 个 研 究 直 接 促 进 了 4 年 后Weissleder等在小鼠体内利用 Pd纳米材料催化释放阿霉素的研究[85],由于该 Pd纳米材料能有效地在肿瘤部位累积,这种策略可以极大降低阿霉素的毒副作用.Pd催化的生物正交剪切反应也可用于微针药物递送等领域.最近,Gu研究组开发了一款能够实现化疗药增效减毒的生物正交 催 化 贴 剂 (BioorthogonalCatalyticPatch),将其贴在小鼠黑色素瘤周皮肤上,明显减慢了肿瘤增殖速度[86].

　　5 总结与展望

　　生物正交反应为化学生物学发展和研究生命进程带来了革命性的技术方法,为该领域的核心研究策略之一.过去的20年见证了众多研究团队对 CuAAC,SPAAC,IEDDA 等反应的机理、反应速率、反应前驱体的设计等进行的深入研究.由于其高度的专一性、较高的反应速率和良好的生物兼容性,生物正交反应在细胞和动物中有着越来越多的应用.研究者们可以对蛋白质、核酸、脂质、糖等生物大分子定点修饰进而成像,也可以对细胞、组织和活体动物等不同层面的生物结构进行观测.

　　近年来由于药物耐药性问题的不断出现,快速发现新的活性药物骨架和新型疾病相关靶点抑制剂等方法备受关注.生物正交反应已经在激酶如乙酰胆碱酯酶抑制剂的发现中逐渐崭露头角,也加速了 PROTACs连接方式的优化.在疾病尤其是肿瘤的靶向治疗中,生物正交剪切反应也受到了药学研究者的青睐,既可以用于蛋白药物的靶向递送,也对小分子药物在肿瘤部位的富集和渗透起到了极大的促进作用,从而提高了其治疗效果并能降低药物毒性.

　　不仅如此,生物正交反应对于在细胞中原位进行药物靶点发现和药物动力学研究也有重要意义,也可以与蛋白谱学分析技术相结合,提高药物脱靶性研究的可靠性.在当今生物正交反应面临反应新拓展和应用新升级的关键时期,研究效率更高、原料更加易得、相互正交性和生物兼容性更好的反应类型仍然是个长期挑战,尤其是用于活体动物的生物正交反应升级更加迫切和艰巨.技术为应用而生,如何将这些革命性的技术应用在解决生命科学和原创新药发现中,是生物正交反应的下一个重要发展方向.期待生物正交反应在临床诊断、小分子药物、蛋白质前药和 ADC等药学领域中有更加广阔和有效的应用前景.

　　参考文献:

　　[1] PRESCHERJA,BERTOZZIC R.Chemistryinlivingsystems[J].NatureChemicalBiology,2005,1(1):13-21.

　　[2] SLETTEN E,BERTOZZIC.Bioorthogonalchemistry:fishingforselectivityinaseaoffunctionality[J].AngewandteChemieInternational Edition,2009,48(38):6974-6998.

　　[3] AGARD NJ,BERTOZZIC R.Chemicalapproachestoperturb,profile,andperceiveglycans[J].AccountsofChemicalResearch,2009,42(6):788-797

　　.[4] HANG H C,WILSONJP,CHARRON G.Bioorthogonalchemicalreportersforanalyzingproteinlipidationandlipidtrafficking[J].AccountsofChemicalResearch,2011,44(9):699-708

　　.[5] FLORESJ,WHITE B M,BREA RJ,etal.Lipids:chemicaltoolsfortheirsynthesis,modification,andanalysis[J].ChemicalSocietyReviews,2020,49(14):4602-4614.

　　[6] YAOZJ,ZHANG Y,CHEN PR.Recentprogressonthedevelopmentofprobesforfluorescentimagingandbio-orthogonalreactions[J].ChineseScienceBulletin,2013,58(28/29):2872-2885.

　　[7] HU YX,ZHANGJY,MIAOYX,etal.Enzyme-mediatedinsituself-assemblypromotesinvivobioorthogonalreactionforpretargeted multimodalityimaging[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2021,60(33):18082-18093.

　　作者：温 琪1,2 罗嘉琰1,3 邵浩东1 邓张双4 滕 鹏1

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