对照提取物用于金银花药材的质量控制方法

所属分类：医学论文阅读次时间：2016-06-27 17:26

本文摘要：本篇中药材论文通过采用对照提取物办法研究金银花药材的质量控制方法。一般情况下，对中药材进行多指标含量测定，需要采用纯度较高(98%以上)的对照品，由于对照品分离纯化过程较为复杂，所以价格较高，给中药生产企业造成一定的经济负担，不利于多批次中药材

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　　本篇中药材论文通过采用对照提取物办法研究金银花药材的质量控制方法。一般情况下，对中药材进行多指标含量测定，需要采用纯度较高(98%以上)的对照品，由于对照品分离纯化过程较为复杂，所以价格较高，给中药生产企业造成一定的经济负担，不利于多批次中药材的质量控制，本文提出的采用对照提取物作为对照，建立标准曲线，可实现对金银花药材的多指标含量测定。

　　《天然产物研究与开发》(月刊)创刊于1989年，是由中国科学院主管、中国科学院成都文献情报中心主办的我国最早报道天然产物研究与开发的专业性学术刊物。办刊宗旨：报道天然产物研究的最新成果，开发天然产物研究的广泛用途，促进国内外学术交流，加强科研、开发、生产的进程，传播具有战略性、前瞻性和创新性的科技成果，以促进我国科技与经济发展。

　　[摘要] 为解决中药材色谱分析中对照品价格较高的问题，该文以金银花药材为例，提出采用对照提取物作为参考物质，对药材进行常规分析的方法。采用对照品对对照提取物进行了标定，测定出其中6种有机酸类化合物的含量，并考察了对照提取物的长期稳定性。利用对照提取物配制不同浓度的溶液，建立了标准曲线。对11批次金银花药材进行分析，采用t检验方法对分别利用对照品和对照提取物测得的结果进行比较，结果表明二者之间不存在显著性差异。该方法可用于金银花药材的质量控制，并对解决类似问题有借鉴意义。

　　[关键词] 对照提取物;金银花;质量控制;有机酸

　　多指标含量测定及指纹图谱技术是对中药材进行质量控制的有效手段，但面临着对照品价格昂贵、不易获得，从而导致分析成本较高的问题，加之目前药典中规定的中药材含量测定指标较少，中药生产企业不愿在中药原料药材的多指标含量测定上投入更多资金，限制了该技术在中药生产企业的推广使用，难以实现质量标准的提高。为解决这一问题，近年来出现了“一测多评”的新型中药材多指标含量测定方法，并被录入药典[1]，该技术不仅在很大程度上解决了上述问题，而且引导了相关的科研工作者探索新的中药材质量控制方法，采用对照提取物对中药材进行多指标质量控制就是一种新的思路。

　　金银花Lonicera japonica Thunb.是中医临床常用的药材，其中的主要化学成分包括挥发油、有机酸类化合物、黄酮类化合物和三萜皂苷类化合物[2-3]。李萍等对该药材进行了系列研究，从中分离出多种对照品，并利用分离出的对照品建立了多个多指标含量测定方法，用于对金银花药材进行质量控制[4-7]。药理实验表明，有机酸类化合物是主要的药效物质，主要包括绿原酸(chlorogenic acid， CA)、咖啡酸(caffeic acid， CfA)、新绿原酸(neochlorogenic acid， NCA)以及异绿原酸等，其中异绿原酸是二咖啡酰奎宁酸(dicaffeoylquinic acid， DCA)的一组同分异构体，主要包括3，4-二咖啡酰奎宁酸(3，4-DCA)、3，5-二咖啡酰奎宁酸(3，5-DCA)和4，5-二咖啡酰奎宁酸(4，5-DCA)等[8-9]，但以上化合物的纯品由于制备困难，所以成本较高，不适于工厂多批次药材的常规分析。

　　对照提取物是指化学成分及其含量较为明确、稳定性较好且纯度较高的中药提取物。其中的化学成分及其含量已经采用对照品进行标定，可配制成不同浓度的系列标准溶液，用于原料药材中多种化学成分的含量测定[10-11]。本文利用“对照提取物”作为参考物质，对金银花药材进行多指标含量测定，效果满意，进一步证实了该方法用于中药材质量控制具有可行性。

　　1 材料

　　Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司); MILLIPORE超纯水器(美国Millipore公司);KQ-250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);METTLER AE240型1/1万电子天平(梅特勒-托利多公司);FL-027高速台式离心机(德国Eppendorf公司)。

　　实验用乙腈、甲酸均为色谱纯，实验用水为超纯水。CA、CfA对照品购自中国食品药品检定研究院，NCA，3， 4-DCA，3， 5-DCA，4， 5-DCA由本实验室自制，纯度均大于95%(采用色谱峰面积归一化方法计算而得)。金银花对照提取物样品由上海凯宝药业有限公司提供。金银花药材购自亳州中药材市场，经浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾。

　　2 方法与结果

　　2.1 对照提取物的标定所用的对照提取物由上海凯宝药业有限公司生产，为金银花药材经过煎煮、浓缩、醇沉、萃取等一系列的分离纯化步骤后得到，6种目标成分的质量分数加和值在 60%以上。在用其作为标准参考物质之前，先采用作者所在实验室自建的HPLC进行标定[12]，该方法采用6种有机酸对照品建立工作曲线，并进行了方法学验证，所用色谱条件如下。Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为0.1%甲酸溶液(A)，0.1%甲酸-乙腈(B);采用二元梯度洗脱，洗脱程序为0～25 min， 8%～8% B;25～30 min， 8%～19%B;30～60 min， 19%B;流速 1 mL·min-1;检测波长 280 nm;柱温 25 ℃;进样量 10 μL。在此色谱条件下，所得混合对照品和对照提取物的色谱图见图1。

　　对照提取物中的6种目标成分得到了基线分离且峰形良好，可进行准确测定。利用DAD检测器得到的化合物光谱进行各目标成分色谱峰的纯度分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA的纯度分别为 99.86%，97.89%，98.95%，99.69%，99.29%，98.79%。对批号为081207的提取物进行了标定，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA等6种有效成分的质量分数分别为 3.81%，11.29%，20.99%，4.63%，7.04%，17.02%。

　　2.2 对照提取物稳定性考察采用提取物作为标准参考物质，要求其具有满意的稳定性，能够在较长的时间内使用，所用的提取物第1次标定后密封，置于冰箱内冷藏，2年中共进行3次标定，结果见表1，RSD均小于3%，表明该提取物在3年内具有较为满意的稳定性。

　　2.3 供试品溶液制备称取1 g金银花药材粉末置于25 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，超声提取2 h后，重新定容至25 mL，取提取液1 mL，1万 r·min-1下离心10 min，取10 μL上清液用于HPLC分析，药材提取液与提取物HPLC分析方法相同。

　　2.4 线性关系考察标定后的对照提取物实际上相当于一种“混合对照品”，可用其配制成一系列不同浓度的溶液，制定工作曲线，拟合出回归方程，实现对药材样品的测定。精密称取 50 mg对照提取物，溶解于50%甲醇中，并定容至10 mL，作为储备液，然后逐级稀释，制成不同浓度的溶液，按照2.1项下条件进行液相分析，并制定出标准工作曲线，6种有效成分的回归方程见表2。

　　所建标准曲线及相关系数(R2)符合定量分析的要求，可用于供试品中6种有机酸类化合物的含量测定。

　　2.5 精密度日内精密度，按照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，精密量取同1份供试品溶液，重复进样6次，按照2.1项下色谱条件进行分析，计算6种有机酸的峰面积的RSD，见表3。日间精密度，按照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，精密量取同1份供试品溶液，6日内每日进样1次，按照2.1项下色谱条件进行分析，计算6种有机酸的峰面积的RSD，见表3。

　　2.6 稳定性按照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0， 2， 4， 8， 16， 24 h精密量取同1份供试品溶液10 μL，按照2.1项下色谱条件进行分析，计算6种有机酸的峰面积的RSD，见表3。

　　2.7 重复性按照2.3项下供试品制备方法，用同1批次药材制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行分析，计算6种有机酸的峰面积的RSD，见表3。

　　2.8 加样回收率采用加样回收法，精密称取已知含量的金银花药材1 g，加入5 mg的对照提取物，按照2.3项下供试品制备方法，制备6份平行供试品溶液。按照2.1项下色谱条件进行分析，计算6种有机酸的回收率，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA对应的回收率分别为 99.81%，95.34%，102.9%，100.6%，98.02%，96.79%，RSD分别为 3.0%，2.1%，4.2%，1.8%，2.9%。

　　2.9 金银花药材分析结果以上结果表明，利用对照提取物所建立的分析方法，精密度、稳定性、重复性和加样回收率可满足定量分析的要求，可用于金银花药材样品的定量分析。分别采用对照品和对照提取物建立标准工作曲线，测定了购自亳州中药材市场的11个批次的金银花药材，测定结果见表4。

　　采用配对t检验的方法对2种方法测得的含量进行比较，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA对应的P分别为 0.180，0.817，0.587，0.329，0.017，0.871，均大于0.05，表明二者之间不存在显著性差异。采用OriginPro 8统计学软件对2种方法测得的结果进行相关性分析，NCA，CA，CfA，3，4-DCA，3，5-DCA，4，5-DCA对应的相关系数分别为 0.999 5， 0.999 3， 0.990 9， 0.958 1， 0.999 0， 0.996 1，均在0.95以上。以上结果表明可采用对照提取物对金银花药材进行质量控制。

　　作者认为，符合对照提取物条件的物质必须具备以下3个条件：一是来源于需要进行质量控制的药材，具有较强的针对性;二是纯度较高，可知目标成分总量要占较高比例;三是稳定性较好，可供长期使用。本文对这一方法进行了初步探索，真正实现在生产企业中应用还需要相关工作者进行进一步研究。