端粒酶检测新方法研究进展

　　摘要：端粒酶是一种核蛋白逆转录酶，能以自身的RNA为模板添加重复序列(TTAGGG)至染色体末端，稳定端粒长度。端粒酶在05%-90%的癌细胞中处于激活状态，已经引起了人们的广泛关注，成为肿瘤诊断和临床治疗的重要突破口。因此，准确、高效地测定端粒酶活性具有重要意义。近年来，许多灵敏、准确的体外或原位检测技术在端粒酶活性检测方面得到了发展。该文综述了近年来端粒酶活性检测的最新进展，并对其发展趋势进行了展望。

　　关键词：端粒酶;酶活性检测;电化学;荧光;比色法;成像;综述

　　端粒和端粒酶在保证细胞分裂时染色体的完整复制、免于退化方面起关键作用。端粒酶是染色体的自然脱落物，能引注老和癌症。在新细胞中，细胞每分裂一次，端粒就缩短一次。当端粒不能再缩短时，细胞即无法继续分裂而死亡。大约90%的癌细胞都有着不断增长的端粒及相对来说数量较多的端粒酶大量研究数据证明，端粒酶活性在正常体细胞中被抑制，正常组织细胞中几乎检测不到端粒酶的活性，但其在肿瘤细胞中高度表达，大约99%的癌细胞如膀胱癌、乳腺癌、胃癌细胞中可以检测到高活性的端粒酶[3]。

　　因此，端粒酶作为一种潜在的肿瘤标志物，其检测对癌症的预防、早期发现以及预后效果的判断均具有重大意义。早期的端粒酶活性检测方主要有端粒重复序列扩增法(TRAP)-6、端粒重复序列延伸法[7]、化学发光法、实时定量荧光聚合酶輕反应(PCR)法⑴〕等。近年发展起来的很多新的基于各种纳米材料和新技术的高灵敏检测端粒酶活性的方法，如电化学检测法[I0■I9]、比色法[1]、荧光法飞]、表面增强拉曼光谱法[1]等，为端粒酶的检测提供了新选择。

　　本文重点介绍近年发展的端粒酶检测新方法O1电化学检测法电化学分析方法作为一种经典的分析方法，具有特异性好、操作简单、仪器价格低廉等优Ro近年来，用电化学分析方法来检测端粒酶活性的工作]10'10-15]被大量报道。基于DNA上的磷酸基团可与钳酸盐反应生成有电化学活性的磷钳酸盐，Wang等[10]建立了一种用于端粒酶活性测定的超灵敏电化学传感器。该检测体系对104~107Helpcells/mL的端粒酶活性有线性响应,检测限为49HeUce/s/mL。Ldg等口合成了吓咻金属有机框架(PpMOF)材料,在表面包裹链霉亲和素(SA)后得到PpMOF@SA材料，该材料可在接近电极表面时电催化氧气发生还原反应，产生电流信号。该研究通过端粒酶将其引物扩增形成发卡结构,并释放与引物互补的DNA,互补DNAR修饰在电极表面的发卡DNA杂交，发卡DNA上的生物素通过与PpMOF@SA结合,还原氧气产生电流，从而实现端粒酶的检测。此外,研究者们还开发了端粒酶的免标记电化学检测方法。

　　例如,Lx等建立了一种基于T核酸外切酶辅助靶循环的均相、灵敏、快速、简便的电化学策略，用于癌细胞中端粒酶活性的检测[2]。无端粒酶时，标记有亚甲基蓝(MB)的发卡DNA远离电极表面,MB的电流信号较弱;有端粒酶时，端粒酶扩增产物与发卡DNA形成互补双链,T核酸外切酶切割双链DNA，此时由于正负电吸引作用,MB靠近电极表面。该方案中，端粒酶引物可以循环利用，提高了检测的灵敏度。Wu等也发展了一系列免标记电化学检测端粒酶活性的新方法。他们以DNA正四面探针固定端粒扩增引物并将其修饰到金电极表面,端粒酶扩增出(TTAGGG)a富G序列形成G-四链体后,具有过氧化物类催化活性，可催化苯胺聚合,形成具有电化学活性的聚苯胺,进而可通过示差脉冲伏安法检测聚苯胺的电化学信号来检测端粒酶活性。该法最低检测限为1个细胞19咽,与单链端粒引物探针相比，信号强度提高22倍[5]。

　　此外，他们还设计了一种基于氧化铝纳米通道的无标记端粒酶活性检测新方法[41],以及无标记、无电极修饰的检测端粒酶活性的新方法[4]。Zhang等将聚鲁米诺—白纳米(polyluminol-PtNPs)材料修饰在氧化锢锡((TO)电极表面，利用端粒酶引入修饰的DNA@MSN@PMA作探针,采用电致化学发光法检测了细胞内端粒酶的活性〔刃。Feng等利用硫化镉半导体纳米材料(CdSNCs)和鲁米诺-金纳米复合材料(L-AuNPs)间的能量转移(ECL-RET),实现了端粒酶的活性检测海。

　　Xmng等合成了钉掺杂的金属有机骨架，并利用ECL-RET原理实现了端粒酶的检测[7]。2比色法检测端粒酶活性与电化学检测相比，比色法通过裸眼观察溶液颜色及其深浅来判断有无目标物和目标物含量,是一种直观、简便、易于快速操作的分析检测方法。与其它分析检测方法相比，比色法不需要借助于昂贵的仪器,对操作人员的技术要求不高，因此越来越受到人们的关注[24■02]。在K+Rhemin的存在下,端粒酶在引物3'端扩增出的富含G的DNA序列会形成hemin-G-四链体纳米结构,该纳米结构具备辣根过氧化物酶催化活性。Fyeman等将制备得到的hemin-G-四链体用于催化3,3端7,5，-四甲基联苯胺(TMB),端粒酶含量越多，得到的TMB*越多，进而可通过TMB紫外吸收值的变化实现端粒酶的检测,其最低检测限为227ce/s/辺5]。

　　纳米金(AuNPs)是一种很好的比色法探针，当AuNPs之间距离彳驗时，溶液呈红色;当AuNPs距离靠近时，其紫外吸收峰发生红移，溶液变成蓝色。WXUer等基于左旋半胱氨酸(Z四ystexe)的辅助作用，通过端粒酶扩增引物(TS)扩增后形成的hemd-G-ra链体控制AuNPs的聚集和分散,并实现了端粒酶活性的检测旳。Wang等也提出了利用TS修饰AuNPs比色法检测端粒酶活性的方法[5]。Xx等以双功能化的金胶为探针,发现当膀胱癌患者尿液中端粒酶活性水平不同时，该探针可呈现出4种不同的状态(蓝色、紫色、红懿沉淀)[4]。Wei等研究了hemin复合的石墨烯(H_GNs)、金纳米棒等纳米材料在端粒酶检测中的应用。

　　H-GNs在盐溶液中具有可调控的分散性和类过氧化氢酶活性。端粒酶活性不同时，H-GNs团聚程度不同，因而催化TMB的显色程度不同，所以可以通过肉删&察溶液颜色的变化来判断端粒酶含量[0]。他们还提出了一种基于hemin-G-四链体类过氧化物酶催化刻蚀金纳米棒的方法来比色检测端粒酶：以金纳米棒(GNRs)为探针，端粒酶活性不同，金纳米棒被刻蚀的程度不同，其溶液呈现红、灰、蓝、紫、粉红等颜色，基于此可实现对端粒酶的快速、简单、可视化检测[1]。

　　3荧光法检测端粒酶活性

　　荧光法是生物分析中的常用方法，该法可将待测物质的有无和含量多少通过荧光信号输出的分子光谱峰位置以及强度表示出来。与一般检测方法相比，荧光法具有灵敏度高、能够实时原位检测以及可生物成像等"2-3，等优势。

　　国内外有不少利用荧光法检测端粒酶活性的研究。Ma等设计了能特异性识别端粒酶，同时又能够释放出广谱抗肿瘤药物阿霉素(Doa)的荧光探针，基于此建立的检测平台能够实现端粒酶活性检测、细胞成像以及肿瘤治疗的一体化炉]oYang等设计了一种基于荧光能量共振转移(FRET)原理的探针，用于细胞内端粒酶活性检测和细胞成像研究讯]o他们将修饰有异硫氧酸荧光素(FITC)和四甲基罗丹明(TAMRA)的DNA(该DNA命名为Flare)作为探针，当探针进入到含有端粒酶的细胞中时，延伸出来的序列将Flare置换出去，形成发卡结构，Flare离开AuNPs表面。此时FITC和TAMRA距离很近，且没有AuNPs的猝灭作用，使得TAMRA荧光信号大大增强。Ma等发展了一种基于

　　2-氨基瞟吟无猝灭分子信标检测端粒酶活性的方法。当端粒酶引物被扩增后，随着大片段(KF)聚合酶的加入，引物沿着模板延伸，与加入的发卡DNA形成双链，同时分子信标被T7酶卩前，释放出游离的分子信标和引物延伸链，引发下一轮T5外切酶卩前。该方法实现了双重信号放大，具有高灵敏度和特异性，在抗肿瘤药物的开发方面具有重要意义[33]O还有一些科学家设计了更为巧妙的免标记法检测端粒酶的活性。Zhon等开发了一种基于构象开关的端粒酶活性的荧光检测方法。

　　该法通过使扩增产物与无活性的适体分子(Spmach)杂交，触发适体的构象转换，随后Spinach与荧光分子结合，产生绿色荧光，通过加入核糖核酸酶(RNaseH)将杂交的双链切掉，释放端粒酶扩增产物，如此循环利用，可使荧光信号得到进一步增强。该荧光生物传感器的检测限为104个细胞国]o此外，Wet等提出了基于TOTO-1对单链DNA中G碱基的高灵敏度和高选择性检测端粒酶的方法，通过引入Ealll核酸外切酶对引物链消化，极大地提高了方法的灵敏度。该方法对端粒酶的检测范围为2~7000cede/mL，最低检测限为2cede/mL[7)]。

　　在荧光检测法中，原位检测技术能够在活细胞内研究癌症标志物的动态，分析其表达的机会及表达水平，实现癌症标志物的快速、灵敏检测。目前许多研究将纳米材料与信号放大技术结合形成纳米探针,并以胞吞的形式进入细胞，实现目标物的原位检测。如Qmn等设计了对端粒酶响应的介孔硅纳米粒子(MSN)探针，并实现了端粒酶活性的高灵敏检测以及细胞成像研究o他们在带正电荷的MSN孑LR上修饰荧光猝灭基团2,5-二特丁基对苯二酚(BHQ)和带正电荷的荧光素，并用DNA链对MSN孔道进行封堵。端粒酶扩增产物通过和封堵DNA杂交，使之从MSN表面脱落，释放荧光素，产生荧光，该方法可用于细胞成像o此外，Zhuang等利用聚集诱导发光(AIE)的特性，开发了一种快速灵敏的生物探针，利用端粒酶将引物扩增后形成的带高密度负电荷的单链DNA，引起AIE分子的聚集诱导发光，并将其用于细胞内原位成像来检测端粒酶活性展O

　　4表面增强拉曼光谱法

　　表面增强拉曼法光谱(SERS)具有检测限低、特异性好、操作简便、待测样品状态不受限制等特点,在生化分析领域应用广泛[43-7]OXu等以AuNPs为材料进行DNA自组装，合成了金字塔型的拉曼探针用于端粒酶活性的检测和细胞成像43]o他们在4个15nm左右的AuNPs表面修饰上4条DNA单链，并将其和Cy5标记的指示探针(RS)以及端粒酶引物(TS)互补配对，组成具有拉曼信号的检测探针。端粒酶扩增产物可使RS从双链上脱落，拉曼信号消失。将该探针与含有端粒酶的癌细胞进行孵育，由于AuNPs具有良好的生物相容性并且能够进入细胞，在细胞内产生荧光信号，进而实现了端粒酶的细胞成像研究。Eom等构建了基于纳米孔道金纳米线(AuNW)SERS检测器检测癌细胞和组织中端粒酶活性的平台理。通过在AuNW上溅射沉积Au获得富含纳米空孑L道的AuNW，AuNW具有稳定的拉曼信号，而MB是一种可以嵌入G-四链体结构的具有拉曼增强效应的分子。当端粒酶扩增的富G序列形成G-四链体后，正电性的MB分子嵌入G-四链体内，增强富含纳米孑LRAuNW的拉曼信号，从而实现癌细胞和癌症组织中端粒酶活性的检测。该方法非常灵敏，最低检测限可达0.2个癌细胞。

　　5局域表面等离子体共振技术

　　免标记的局域表面等离子共振(LSPR)检测技术具有很高的时空分辨率，能够进行单颗粒水平原位生物过磁化学反应的研究⑷一4]。Ld等建立了基于等离子体共振散射光谱和暗场显微镜原位检测端粒酶活性及细胞成像的方法。他们利用端粒酶引物将50nm的金(核)和13nm的金(卫星)组装制得Au50@Anl3复合探针，该探针在暗场显微镜下呈橙色。

　　当引物被端粒酶扩增后，扩增产物杂交形成发卡结构，Au50@Anl3探针发生去组装，探针发生显著LSPR位移，散射光由橙色向绿色渐变。该设计极大提高了单粒子的检测灵敏度，检出限低至1.3xl0-15IT,可监测药物诱导的细胞内端粒酶活性变化[54]。6结论与展望端粒酶是重要的肿瘤生物标志物之一，实现简单、准确的端粒酶活性评价是本领域研究者孜孜不倦的追求。

　　最近几年，端粒酶活性的检测新方法已经克服了原位端粒酶活性检测的挑战，实现了从体外到活细胞内端粒酶成像的检测。尽管方法的高灵敏度和方便快捷性尚未能很好的兼顾，稳定性方面也有待改进,这些方法険不能直接用于临床诊断和癌症患者的药物治疗效果监测。然而荧光技术对端粒酶在活细胞中的内成像做出了巨大贡献，可以预期，DNA组装的纳米探针，如AuNP/DNA和PtRPs/DNA在抗癌药物从体外运输进入体内方面具有巨大的潜力，实现端粒酶监测、肿瘤治疗与荧光成像一体仍有很大的研究空间。因此，发展对端粒酶活性分析的简单、灵敏、低成本的原位实时监测仍然是当前亟待的。

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