人体样本中脂肪酸分析方法研究进展

　　【摘要】综述了人体样本中脂肪酸分析常用的预处理方法、衍生化技术和仪器分析技术的发展情况;重点总结了衍生化技术在脂肪酸分析中的应用现状和进展;阐述了最新仪器检测方法，如“鸟枪”式直接进样法和“中心”二维质谱法在该领域的最新发现;回顾了重要脂肪酸参考值范围。综述认为开发选择性好、效率高、稳定性强的衍生化技术，使用脂肪酸内源性血浆/血清的质量控制品以及与被测组分性质相似的内部标准品，是获得脂肪酸分析准确、可靠结果的有效途径。

　　关键词：脂肪酸;生物样本;分析方法;研究进展

　　脂肪酸是人体能量储存、细胞结构和细胞信号转导等多种生化途径的重要代谢物。近期研究发现，某些脂肪酸组成变化与机体内代谢水平异常以及疾病呈显著相关，如肥胖、胰岛素代谢紊乱、阿兹海默症、癌症等代谢异常或生理异常都会影响体内脂肪酸组成[1]。

　　脂肪酸论文范例： 反刍动物肌内脂肪及脂肪酸调控研究进展

　　已有文献报道，脂肪酸组成可以作为临床综合诊断指标，如血清中C16:1n7/C16:0是鉴别脂肪肝与脂肪性肝炎的指标[2];儿童注意缺陷与多动障碍患者血浆中多不饱和脂肪酸浓度低于正常值[3]。由此可见，定量分析脂肪酸组成对营养评估及临床诊断有重要价值。人体样本中脂肪酸含量低、分类繁多且生物样品基质复杂，分析方法常常难以获得令人满意的定性能力和检测灵敏度，极大制约了脂肪酸研究的进一步深入。

　　目前，分析生物样本中脂肪酸的检测方法主要有气相色谱类方法、液相色谱类方法以及酶联免疫法，其中气相色谱类方法是最成熟也最经典的方法，非常适合脂肪酸组分分析。而液相色谱类方法近几年来的创新点主要集中在设计、合成新型脂肪酸衍生化试剂，达到降低基质效应、提高灵敏度的目的。酶联免疫法虽然能在短时间内检测生物样品中的DHA，但一次只能获得单种游离脂肪酸的检测值。

　　本文综述了近年来人体样本中脂肪酸的分析方法及研究进展，重点讨论了不同样品中脂肪酸的提取方法、基于衍生化的色谱和质谱分析方法以及文献报道中的参考值范围;拟通过对这些研究成果的综述，为建立我国人体样本中脂肪酸检测标准化方法和人群标准参考值提供借鉴。

　　1脂肪酸检测的预处理方法

　　研究者通常根据研究目的不同，提取不同研究对象中的游离脂肪酸或/和酯化脂肪酸或是全脂质。游离脂肪酸可在酸化条件下用烷类溶剂提取。Quehenberger等[4]用盐酸甲醇酸化样品后，用异辛烷提取了细胞、血浆、肝脏匀浆液、脂肪匀浆液中的游离脂肪酸。但此法不适合含磷酯较多的样本，因为磷酯在酸化条件下易分解产生游离脂肪酸，对检测造成干扰。

　　在分析血浆、血清、母乳等液体中的游离脂肪酸和酯化脂肪酸时，经常采用先酸解再皂化的方法。美国CDC[5]取100μL人血清或血浆，加盐酸乙腈溶液酸解，氢氧化钠甲醇皂化，分析了人群血清中30种脂肪酸。Santos等[6]优化了此法，将酸解和皂化的时间延长，建立了健康人血浆中31种脂肪酸含量参考范围。长链多不饱和脂肪酸极性小、疏水性强，正己烷提取效果欠佳。

　　Serafim等[7]采用冰浴后的正己烷：异丙醇(3:2,v/v)，提高了溶剂萃取效率，获得了血浆中5种长链/超长链不饱和脂肪酸。 在分析总脂质成分时，常采用经典的Folch[8]或Bligh-Dyer[9]脂质萃取法。简要来说，Bligh-Dye法中氯仿/甲醇/水的体积比为1:2:0.8，适用于组织、细胞内少量脂质提取;Folch法氯仿用量大，氯仿/甲醇/水的体积比为8:4:3，更适合含大量脂质的样品。在一些优化方法中，常用毒性更小的二氯甲烷来代替氯仿，具有相似效果。肠道内容物或粪便中含有较多的短链脂肪酸，具有分子量小、挥发性高、水溶性较大的特点，一般用沸点低、易去除的乙醚或乙醇提取[10]。提取时加入盐酸、硫酸、偏磷酸等，可阻止短链脂肪酸水解，有效沉淀蛋白等杂质，提高回收率。

　　2分析方法

　　脂肪酸这类物质较难气化，没有良好的电离基团和显色基团，在气相色谱类或液相色谱类仪器中灵敏度较低。但脂肪酸在衍生化后，能获得良好的色谱分离和质谱定性效果，实现复杂组分的准确定量、定性。此外，使用同位素内标也能在一定程度上减小基质效应和操作误差。

　　2.1气相色谱法及气相色谱-质谱联用法

　　气相色谱类分析技术与衍生化方法联用是目前应用最广泛的脂肪酸检测方法，具有定性定量准确、针对性强的特点。

　　其中，甲酯化方法是由脂肪酸与甲醇在各种催化剂条件下生成脂肪酸甲酯，其常用的方法有三氟化硼/甲醇法[11]、硫酸/甲醇法[6]、乙酰氯/甲醇法[12]等;脂肪酸甲酯具有正电性，适合GC-FID[11]、GC-MS-EI[13,14]、GC-TOF-MS[12]等仪器分析。Abdelmagid等[11]采用气相色谱法检测了人血浆中13种长链脂肪酸，建立了正常人群脂肪酸含量参考范围，用以判断缺乏、过剩及与慢性疾病的关联。

　　方法用14%三氟化硼/甲醇法衍生化，外标法定量，中强极性色谱柱检测。但是由于血液样品量少，无法进行回流条件，三氟化硼不能快速甲酯化，反应温度高时间长，甲酯化效率较低。 为了进一步降低检测限，Santos等[6]采用大体积进样气相色谱-真空紫外光谱法(LVI-GC-VUV)检测了人血浆中31种脂肪酸，作为诊断代谢疾病的指标。方法进样量400μl，用2%浓硫酸甲醇溶液甲酯化。研究者常根据待测物性质和实验条件选择不同浓度的浓硫酸/甲醇溶液，浓硫酸用量一般在2%-10%之间。

　　在脂肪酸检测时，经常发生几种不同物质具有相同保留时间或保留时间很接近的现象，如亚油酸和α-亚麻酸，使用质谱有效避免了混淆。对于GC-MS，使用EI源得到大量碎片信息后，可以通过标准谱库进行结构鉴定。Ukolov等[15]采用GC-MS-EI、非极性色谱柱分析血浆、尿液中39种游离脂肪酸，采用氢氧化四丁基铵催化剂、碘甲烷衍生化试剂对脂肪酸进行甲酯化，二氯甲烷提取。

　　这种甲酯化方法可在室温下快速反应、无需禁水。方法考察了样品的保存温度和保存时间，发现样品在-20℃或-70℃下保存没有区别，但保存时间超过2个月时多数脂肪酸测定值明显降低。ChanSeo等[13]采用三氟乙酰胺(MTBSTFA)与脂肪酸生成烷基化衍生物，在选择离子模式下用GC-MS-EI分析人血浆中44种脂肪酸。脂肪酸烷基化衍生物在EI离子源中规律性地丢失叔丁基或甲基，形成响应较强的特征离子对[M-57]+、[M-15]+以及脂肪酸带电离子[M+]，易于辨别。但MTBSTFA衍生物遇酸和水立即分解，衍生物保存时要十分小心。

　　另一种GC-MS电离源，NCI负化学电离源的“软电离”效应保持了脂肪酸结构的完整性，有利于脂肪酸衍生物的定性分析。衍生化试剂五氟苄基溴的衍生物具有很高的负电性，性质与NCI源高度匹配，大幅提高了灵敏度。美国CDC[5]采用GC-MS-NCI法调查了人群血浆中30种脂肪酸情况，以五氟苄基溴为衍生化试剂，三乙胺催化反应进行，同位素内标定量，高极性色谱柱分析。此方法用NIST标定值的冷冻人血清中脂肪酸等质量控制物质核查分析过程以及仪器准确性，最大程度提高了血清/血浆中脂肪酸组分检测的可信度。

　　气相色谱-飞行时间质谱联用技术(GC-TOFMS)是最有潜力的气质联用技术之一，TOF质量分析器具有比四极杆气质联用仪更高的分辨率和更宽泛的质量范围(1-1200amu)，质量精度也高，极大改善了谱图的信噪比。MichaelGoettel等[12]采用乙酰氯甲醇衍生化法，GC-TOF-MS定量分析了人血浆中44种脂肪酸，反映了戒烟前后人血浆中的脂肪酸谱的变化，精确定量了C4:0到C32:0的脂肪酸同分异构体及其代谢物。

　　2.2液相色谱-质谱联用方法

　　脂肪酸与不同衍生化试剂结合，可接上紫外基团或荧光基团提高检测信号;也可实现脂肪酸在LC质谱不同离子源的正、负离子模式下电离，提高检测效能。硝基苯肼类是常用紫外衍生化试剂。Chen等[16]使用2-硝基苯肼衍生化方法分析了人血清中18种脂肪酸(C4:0-C26:0)，Phenyl-Hexyl(苯基-己基)色谱柱，方法中过量硝基苯肼类试剂和反应副产物对LC-MS/MS分析的干扰性较小。高永平[17]自制荧光衍生化试剂1-[1-(哌嗪)乙酮]-2-[(4-二甲氨基)苯基]-菲[9,10-d]咪唑(DPPIPE)，柱前衍生化，高效液相色谱-荧光检测器法分析了人体血浆中8种脂肪酸。荧光衍生试剂可以与目标化合物耦合上能产生荧光的生色基团，与荧光检测器联用，提高选择性和10倍以上的灵敏度。

　　文中作者认为分析长链脂肪酸时，C8色谱柱比C18色谱柱更能避免疏水性内源干扰物质。在液相质谱中，通过酰胺衍生化可产生脂肪酸阳离子衍生物，配合正离子模式(ESI+)、流动相中加入甲酸促电离，有效改善了色谱分离度、提高了灵敏度。Bian等[18]通过胆胺衍生化法，改进了长链脂肪酸在人血清中的电离和分离效率，与长链脂肪酸非衍生化方法相比，平均LOD提高了大约60倍。反应时脂肪酸先与鎓盐类缩合剂反应生成中间体，中间体再与胆胺发生反应，加入的三乙胺提供了弱碱性环境促进反应进行。Jiang等[19]提出了一种孪生化衍生化方法。

　　方法用磺酰哌嗪衍生血清样品中的脂肪酸，用二甲基磺酰哌嗪衍生标准品作为定量参照品，进样前1:1混合，仪器中每个脂肪酸都有相应的参照品。由于两种衍生化产物在结构和物理化学性质上都极其相似，血清中脂肪酸与参照品之间的定量差异比使用同位素内标更小，同时有利于在LC-MS/MS中提供一对一的内部标准。短链脂肪酸的理化性质与中长链脂肪酸有较大区别，衍生化能改变其出峰靠前、电离度差的特点。Jaochico等[20]采用含有吡啶的衍生化试剂O-苄基羟胺和碳二亚胺盐酸(EDC·HCL)，建立了反相HPLC-MS/MS方法来定量人血浆和尿液基质中的9种短链脂肪酸方法。

　　吡啶易电离提供了平衡态的弱碱性环境，能促进反应进行。O-苄基羟胺衍生化操作简单、反应速度快、不用加热，不过这种非目标性衍生化反应产生的中间副产物过多，过量衍生化试剂常会干扰检测灵敏度和重现性。Song等[21]采用乙酰肼类化合物吉拉德-T试剂(Girard’sreagentT,GT)和EDC衍生化了直肠真杆菌体外培养基上清液中的5种短链脂肪酸(C2:0-C6:0)。丙酸经GT试剂衍生化后，灵敏度是未衍生化的1.2×108倍，是3-硝基苯肼衍生化时的100倍，灵敏度显著提高。

　　2.3其他分析方法

　　近年来，为了发现新的脂肪酸异构体、研究脂肪酸及其代谢物，研究者们开发出一些新的脂质组学分析法。Zhao等[22]利用“鸟枪”式直接进样法分析了人血浆中不饱和脂肪酸中“C═C”双键异构体。样品不经过色谱柱分离，进样后直接进入质谱，根据电荷差异在离子源内进行分离。实验发现，人血浆中重要脂肪酸C18:1有两种“C═C”位置(∆9和∆11)同分异构体存在。

　　但此法不适合难电离的脂质成分。Wang等[23]开发了一种中心切割二维液相色谱-质谱方法，能在30分钟内识别了血浆中700余种游离脂肪酸及代谢物。化合物由预柱洗脱按极性分为代谢组和脂质组，中心切割系统通过不同阀门将以上2个组分切割到不同的液相色谱柱中进行分离。在一次进样中可得到代谢组分和脂质组分的数千个代谢产物信息，准确辨别双键异构体和对映异构体。

　　3血浆/血清中游离脂肪酸及酯化脂肪酸参考值范围

　　脂肪酸是机体重要代谢标志物，健康人体血浆或血清样本中脂肪酸组成相对稳定。文献[3,16,24,25]中，正常组中棕榈酸、油酸、α-亚油酸的范围在285.4-4064.5µmol/l、178.7～3900µmol/l、279.7～4970.5之间，最低值与最高值之间最大差异在21倍以内。而人们颇为关注的Omega-3家族脂肪酸α-亚麻酸、EPA、DHA的范围在0.8～400.1µmol/l、4.4～829µmol/l、6.4～437.7之间，最低值与最高值的最大差异可达500倍，其参考范围出现了较大差异。

　　但是由于各实验室的分析方法不一样、定量方法既有内标法又有外标法、没有使用标定的质量控制物质校正结果等原因，结果的可靠性较难评判，研究成果仅适用于实验室内部使用，很难说明Omega-3脂肪酸参考范围的差异是正常的还是异常的。此外，一些文献中使用面积归一法计算各脂肪酸峰面积的相对值(%)，没有准确定量值使其数据难以再次分析，无法将数据资源利用充分。而通过标准曲线定量来得到绝对值(临床上常用摩尔浓度表示)，是一种能准确表示脂肪酸含量，也能方便进一步分析、统计的表示方式，具有先进性，应得到广泛使用。

　　4展望

　　脂肪酸组分分析是和膳食摄入、营养健康息息相关的一个领域，对生命科学和临床医学研究意义重大。近年来脂肪酸组分分析方法的研究已取得诸多进展，但在数据分析与整合(不同研究之间、不同人群之间)及与疾病因果关系的探讨等方面仍面临挑战。为此，首先要开发选择性好、效率高、稳定性强的衍生化技术，在脂肪酸中引入易电离的特定基团，能够减弱其极性、增强其挥发性并产生特征化的离子。

　　其次，要开发脂肪酸内源性血浆/血清的质量控制样品和对照品，实现不同检测系统之间的可比性。从公共卫生角度讲，科学、有效的脂肪酸组分分析方法能有效地推动国家水平脂肪酸参考值范围的建立、实现某些疾病早期临床诊断的生物标志物筛选、指导公众脂肪酸合理摄入，为促进人类健康提供有力的科学支撑。

　　[参考文献]

　　[1]BradburyKE，SkeaffCM,CroweFL,etal.SerumFattyAcidReferenceRanges:PercentilesfromaNewZealandNationalNutritionSurvey[J].Nutrients,2011,3：152-163.

　　[2]KazutoshiY，EishiroM,TakuyaS,etal.SerumC16：1n7/C16:0ratioasadiagnosticmarkerfornon-alcoholicsteatohepatitis[J].JGastroenterolHepatol,2019,34：1829-1835.

　　[3]YonezawaK，NonakaS,IwakuraY,etal.Investigationintotheplasmaconcentrationofomega3polyunsaturatedfattyacidsinJapaneseattention-deficithyperactivitydisorderpatients[J].JNeuralTransm(Vienna),2018,125：1395-1400.

　　[4]QuehenbergerO，ArmandoAM,DennisEA,etal.Highsensitivityquantitativelipidomicsanalysisoffattyacidsinbiologicalsamplesbygaschromatography-massspectrometry[J].BiochimBiophysActa,2011,1811：648-656.

　　作者：马妍，陈晨，霍军生

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