牛至精油对常见致病菌的抗菌活性及作用机制研究进展

　　摘要：牛至精油是从牛至全草中提取得到的挥发性物质，含有香芹酚、百里香酚、丁香酚、D-柠檬烯、松油烯-4-醇等多种抗菌活性成分，通过作用于细胞壁、细胞膜、蛋白质、DNA、生物被膜等，在体内外起到有效抑杀金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、弧菌等养殖动物常见致病菌，广泛应用于畜禽、水产动物养殖业中。文章对牛至精油的抗菌活性成分组成、体内外抗菌作用及抗菌作用机制进行综述，以期为牛至精油作为饲料添加剂在养殖业中应用及抗菌剂研发方面提供参考。

　　关键词：牛至精油;抗菌成分;抗菌活性;作用机制

　　在动物养殖的过程中，细菌、病毒、寄生虫等感染性病害频繁发生，但是抗生素的滥用，导致细菌耐药性日益严重。因此，需要寻找高效、绿色、安全的新抗菌药。牛至(OriganumvulgareL.)为唇形科牛至属多年生的芳香草本植物，资源丰富，在我国常以其解表、理气、化湿功效用于防治流感、中暑、呕吐、腹痛、皮肤瘙痒及水肿等疾病[1]，而在欧美等国多以其抑菌、芳香功能作为食品储存保鲜剂和食物烹饪调味剂[2]。

　　牛至精油是通过水蒸气蒸馏法从牛至全草(包含叶、花、茎等)中提取得到的淡黄色或琥珀色透明液体，含有萜类、烷烃类、醇类、酸类、酯类、酚类、醛类等多种化学成分，具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化、免疫调节等作用[3]。目前，牛至精油已应用于食品、医药、化工、动物生产等不同领域，且在养殖业中应用较为广泛。据欧盟动物饲料添加剂和产品(FEEDAP)研究小组的调查评估结果显示，牛至精油按建议添加使用，畜禽无不良反应[4];我国农业农村部也已批准牛至精油为饲料中药添加剂。本文综述牛至精油对养殖动物常见致病菌的抗菌成分组成、体内外抗菌活性及作用机制，以期为牛至油作为饲料添加剂在养殖业和抗菌剂的研发中提供参考。

　　1牛至精油的抗菌活性成分

　　通过气相色谱法/质谱联用仪(GC-MS)等测得水蒸气蒸馏法所得牛至精油能够稳定存在，且含量较高，具有抗菌作用的活性成分[5-7]，主要有香芹酚8.88%~80.0%、百里香酚0.30%~64.0%、丁香酚0.17%~2.04%等;α-蒎烯0.04%~10.78%、D-柠檬烯0.20%~6.91%、石竹烯3.70%~6.09%、β-石竹烯0.39%~7.77%、γ-松油烯0.03%~10.02%等;芳樟醇0.81%、α-松油醇0.32%~0.69%、4-松油醇14.90%等;对-聚伞花素5.36%~29.53%等。

　　许璐等[8]研究发现，牛至油中的主要成分香芹酚、百里香酚对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等养殖致病菌的抑菌圈直径为20.2~58.3mm，最小抑菌浓度(MIC)均为0.313~1.250mL/L，最小杀菌浓度(MBC)为0.313~2.500mL/L，表现出显著的抗菌作用。

　　其他成分如丁香酚对猪源肺炎克雷伯菌[9]、维氏气单胞菌[10]、鳗弧菌的MIC分别为0.002、0.400、0.400g/L[11];D-柠檬烯对金黄色葡萄球菌、耐药铜绿假单胞菌的MIC分别为0.256、0.512g/L[12];松油烯-4-醇对无乳链球菌[13]、MRSA[14]、大肠杆菌[15]的MIC分别为0.098g/L、0.16%、1.56mL/L;α-松油醇对大肠杆菌的MIC为0.78mL/L[15]，均表现出显著的抗菌作用。

　　2牛至精油的体外抗菌作用

　　2.1单一牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、MRSA、乙型溶血性链球菌、粪肠球菌等)、革兰阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、沙门氏菌、荧光假单胞菌等)及真菌(黄曲霉菌、尖孢镰刀菌、念珠菌等)等养殖致病菌具有不同强度的抑杀作用。许璐等[8]测得牛至精油对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌的抑菌圈直径为17.5~52.3mm、MIC与MBC均为0.313~1.250mL/L。牛至精油对产肠毒大肠杆菌、出血性肠炎大肠杆菌、宋氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型溶血性链球菌的MIC为0.04%~0.09%[16]，对黄曲霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌的抑菌圈直径为44.3~45.0mm、MIC为2.7~3.5μL/L[17]。因此，牛至精油具有抗菌谱广、抗菌作用强。

　　2.2复合牛至精油的抗菌作用

　　牛至精油与其他精油的联用，可发挥不同的抗菌效果，以分级抑菌浓度(FIC)为评价指标，FIC<0.5，协同;0.5~1.0，相加;1~4，无关;≥4，拮抗。吴克刚等[18]发现，牛至精油按1∶1联用肉桂、马郁兰或百里香等精油可对大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、致泻性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、黄曲霉起到相加抗菌作用(FIC联为0.125~0.830)。Gutierrez等[19]研究发现，牛至精油按1∶1联用罗勒、马郁兰、迷迭香、柠檬草等精油则仅对蜡样芽孢杆菌有相加抗菌作用，而对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、李斯特菌则表现出无关作用。

　　2.3牛至精油联合抗生素的抗菌作用

　　目前，畜禽、水产养殖致病菌的耐药菌株日益增多，特别是革兰阴性埃希氏菌已表现出交叉耐药和多重耐药。研究发现，牛至精油与沙拉沙星、氟苯尼考、多西环素能够协同抗产ESBLs鸡大肠杆菌(MIC联为0.125mL/L、FIC联为0.375)，与左氟沙星、乙酰甲喹、头孢噻呋、头孢曲松、黏菌素、林可霉素、阿莫西林起到相加作用(MIC联为0.125~0.250mL/L、FIC联为0.50~0.75)[20-21]。

　　3牛至精油在动物体内的抗菌作用

　　牛至精油是一种天然的高活性植物抑菌剂，在畜禽[22]及水产养殖[23]动物的不同生长阶段应用，具有抗菌谱广、驱虫、促生长、毒副作用小、无残留、无耐药性、无三致危害等优点。

　　3.1牛至精油在猪体内的抑菌作用

　　猪病原性腹泻病的致病原有病毒、细菌、寄生虫、霉菌毒素和真菌性等，以细菌性腹泻(大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌等)最为常见[24]。陈会良等[25]按150mg/kg添加10%牛至油预混剂至仔猪日粮中，连喂30d发现，空肠、盲肠、结肠的大肠杆菌数量显著降低7.01%、6.04%、8.60%，说明牛至油能够明显改善肠道微生物菌群结构。

　　黄国清等[26]研究发现，使用300mg/kg牛至精油可有效降低仔猪腹泻率(5.0%)，仔猪腹泻率仅为金霉素组的50%、“金霉素+黄霉素”组的40%;仔猪死淘率(3.33%)仅为金霉素组和“金霉素+黄霉素”组的33.4%。张勇等[27]也发现，按1000mg/kg添加5%牛至油预混剂，可极显著降低仔猪腹泻率(4.08%)、粪中大肠杆菌数量。

　　3.2牛至精油在反刍家畜体内的抑菌作用

　　反刍家畜瘤胃及肠道中含有细菌、原生动物、古细菌和噬菌体等微生物多达7000余种[28]。牛、羊养殖过程中常见的细菌性致病原有肉毒梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、梭状芽孢杆菌等[29]。陈昊等[30]发现，在荷斯坦奶牛全混合日粮(TMR)中按0.28g/头添加牛至精油，连喂110d，可以有效降低奶牛的乳房炎发病率(2.0%)和腹泻率(10.0%)，表明牛至油可以抑制奶牛体内病原微生物的繁殖。

　　杨昭等[31]按0.02%添加牛至精油至TMR中，通过平板菌落计数法、国标乳糖胆盐发酵法检测发现，TMR中霉菌、细菌、大肠菌群数均显著减少。周瑞等[32]按日用量每头7g/d添加牛至精油拌料，连喂82d后发现瘤胃、盲肠及直肠的物种丰度显著提高，明显抑制瘤胃中厚壁菌门、变形菌门、迷踪菌门和绿弯菌门，同时有效降低瘤胃中原虫数(11.88%)，改善瘤胃菌群结构。

　　3.3牛至精油在禽类体内的抑菌作用

　　细菌性疾病是鸡养殖业的常见病和高发病，常见致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等[33]。Jia等[34]在蛋鸡饲喂基础日粮中添加100、200、400mg/kg的牛至精油，结果发现，不同添加量的牛至精油能够显著增加伯克霍尔德菌、放线菌、双歧杆菌、肠球菌科和杆菌科的丰度，而回肠中志贺菌的丰度降低。黄国清等[35]在日粮中按75mg/kg添加10%牛至油预混剂，连喂35d，结果发现，牛至油可降低空肠和盲肠中大肠杆菌数量，提高乳酸杆菌、双歧杆菌数量。除会良等[36]在日粮中按100mg/kg添加牛至精油连喂肉鸡30d后发现，肉鸡盲肠中大肠杆菌数量显著下降，同时空肠中乳酸杆菌数量、盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌数量均显著增加。

　　3.4牛至精油在鱼类体内的抑菌作用

　　鱼类养殖常见的细菌性疾病有肠炎病(肠型点状气单胞菌)、暴发性出血病(嗜水气单胞菌、温和气单胞菌)、赤皮病(荧光假单胞菌)、罗非鱼溃烂病(嗜水气单胞菌)、烂鳃病(柱状屈挠杆菌)等[37]。Oliveira等[38]按0.5%添加牛至精油拌料连喂尼罗罗非鱼4w后，以嗜水气单胞菌攻毒鱼体，15d后发现罗非鱼存活率为53.37%，且存活鱼肾脏未检测出致病菌，表明牛至精油可在体内抑制有害菌的生长。曹升洪等[39]连续3w对罗非鱼投喂添加150、300mg/kg牛至精油的饵料，在攻毒感染嗜水气单胞菌72h内，鱼体的白细胞、NBT阳性细胞数量及溶菌酶活性可恢复至正常水平，有效降低致病菌对鱼体的感染损伤。在吉富罗非鱼的饵料中添加150mg/kg牛至油，可使运动性气单胞菌、假单胞菌病、链球菌感染发病率减少81.5%[40]。

　　3.5牛至精油在虾类体内的抑菌作用

　　南美白对虾常见的细菌性疾病有烂鳃病(弧菌、假单胞菌、气单胞菌)、红腿病(副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、气单胞菌、假单胞菌)、烂眼病(非01群霍乱弧菌)等[41]，其中弧菌感染性疾病最为常见、严重[42]。Gracia等[43]在基础饲料中按5μL/kg添加不同有效成分组成的牛至精油(百里香酚∶香芹酚=48%∶23%、25%∶40%)，连喂4d，结果发现，牛至精油能够显著降低机体内的创伤弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌数量，有效抑制弧菌生长。当在南美白对虾饵料中添加100mg/kg牛至精油，可使对虾弧菌感染所致“红腿病”发生率减少90.5%~93.6%[40]。

　　4牛至精油的抗菌作用机制

　　4.1牛至精油对细胞壁通透性的影响

　　细胞壁能够有效保护菌体形态，控制细胞生长;同时也是化学信号(激素、生长调节剂等)、物理信号(电波、压力等)传递的介质与通路，可进行物质运输与信息传递介导细胞间相互作用侵入宿主。石超峰[15]通过透射电子显微镜下发现，α-松油醇在0.78mL/L浓度下可使大肠杆菌细胞形态变小，形状不规则，结构层次混乱，细胞壁粗糙。吴克刚等[44]将大肠杆菌经过芳樟醇处理后，利用1-苯胺基-8-萘磺酸荧光探针可发现菌体表面疏水性增强，扫描/透射电子显微镜均观察到微观结构发生明显变化(菌体外形萎缩)，结果均表明细胞壁完整性被破坏，使胞内物质泄漏、胞浆分布不均匀。

　　4.2牛至精油对细胞膜通透性的影响

　　细胞膜是包围着细胞质的半渗透薄膜，为细胞生长提供稳定的内环境，也起到屏障保护、物质转运、能量传递、生物功能等作用。Haiying等[45]研究发现，牛至精油可对MRSA细胞膜可造成不可逆的损伤，引起细胞内生物大分子物质的泄漏，抑制三羧酸循环途径及其关键酶，影响代谢产物。Siroli等[46]测定不同浓度的牛至精油(30、40、50mg/L)、百里香酚(40、70、100mg/L)、香芹酚(20、35、50mg/L)作用于李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌后细胞膜脂肪酸组成和挥发性分子谱的变化，结果显示，以上药物均对生长过程中膜脂肪酸谱和产生的挥发性化合物有明显的影响，诱导了细胞膜相关脂肪酸(C15∶0、C16∶0等)的显著增加，特别是不饱和脂肪酸、反式异构体和特异性释放的游离脂肪酸，表明牛至精油、百里香酚、香芹酚能够影响或破坏受试菌株的细胞膜。

　　4.3牛至精油对蛋白质和DNA合成与代谢的影响

　　DNA是遗传信息的载体，蛋白质的胞内生物合成是要在DNA指导下转录、翻译而成，二者共同参与控制细菌细胞生命活动。程峰等[14]通过RNA-seq技术发现，被松油烯-4-醇处理后，MRSA有145个基因表达上调、159个基因表达下调，主要是支链氨基酸的生物合成与氮代谢、ABC转运蛋白超家族等基因差异。石超峰等[47]通过核酸合成抑制试验、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验研究α-松油醇对大肠杆菌的抑菌机理，结果显示，α-松油醇可使大肠杆菌DNA荧光强度明显减弱、可溶性蛋白谱带变浅，表明其作用机制可能是抑制细菌核酸的合成和可溶性蛋白的表达。

　　4.4牛至精油对生物膜的影响

　　生物被膜是细菌的结构化群落，细菌粘附在被膜表面并嵌入细胞外聚合物质的自身基质中，对抗菌剂具有很高的抵抗力，因此，细菌为适应生存环境形成的生物被膜危害更大、抗性更强、抑制或消灭也更困难。Hacioglu等[48]研究显示，牛至油能够抑制白色念珠菌的生物膜黏附和形成，而且作用在成熟生物膜表面后可显著减少其形成(抑制率50%)，同时也对不同浓度的白色念珠菌+金黄色葡萄球菌混合菌液的双重生物膜有效，表明牛至精油对白色念珠菌起有效的抗生物膜作用。靳盼盼[49]分析发现，香芹酚和百里香酚均能抑制阴沟肠杆菌、粪肠球菌生物膜的形成，主要表现为细菌菌体变长、生物膜聚集过程变慢、厚度降低且膜内菌落总数减少、胞外多糖含量降低。

　　4.5牛至精油对群体感应的影响

　　群体感应是一种细胞间交流机制，能够调控生物被膜、腐败酶和毒力因子分泌等。细菌利用群体感应来调节某些表型表达，进而协调机体行为。王雅莹[50]通过转录组学分析发现，香芹酚能够影响与荧光假单胞菌多种生物被膜相关的基因，包括上调多糖代谢、pst系统和PhoB/U双组分系统相关的基因，从而干扰生物被膜的形成，并显著下调菌体鞭毛合成、趋向性蛋白、氨基酸脱羧酶和蛋白酶等与运动和致腐的基因以及编码群体感应LuxR受体蛋白的基因。

　　香芹酚能够作用于靶蛋白LuxR，干扰群体感应通路及其调控的生物被膜和致腐能力。香芹酚[51]、百里香酚[52]可以通过抑制铜绿假单胞菌、肺炎链球菌中LasI的活性，降低群体感应基因(如lasR、LuxS、pfs等)、生物膜和群集运动的表达，干扰细菌的群体感应通路，破坏生物膜使得菌体死亡。

　　5展望

　　虽然牛至精油对细菌感染性病害的防治效果显著，但还存在一些问题：

　　(1)有效抗菌活性成分复杂多样，但多聚焦高含量成分分析而忽略微量成分，成分-成分间相关性研究甚少，综合起效成分组成不明确;同时成分种类及含量易受品种、产地等的影响而动态变化，缺乏有效可控的质量标准。

　　(2)目前研究多为单一精油或成分的体外抗菌活性，与不同挥发油、抗生素的联用研究甚少，综合抗菌或联合抗菌的作用机制和作用靶点尚未明确;并且仅针对单一菌株进行特定环境的静态反应进行研究，缺乏不同条件、多种菌株的交叉动态考察，未能真实模拟实际养殖环境。

　　(3)牛至油虽然在不同品种动物养殖中应用，但缺乏系统的体内外抗菌相关性研究，尚无有效抗菌成分在体内吸收、分布、代谢、排泄等过程的变化分析，无法真正指导养殖用药。因此，牛至精油的整体作用仍待深入研究，且需要建立体内外抗菌作用的相关性，才能有效应用和指导日常养殖。

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　　作者：许巧欣1，2柯怡欣3陈咏琪1张萱萱1蔡延渠1*李钟2*

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