本文摘要：摘要:本研究旨在建立适于绿桐(PaulowniafortuneiPaulowniatomentosa)的快速无性繁殖技术,为试管苗工厂化生产提供技术参考。实验以绿桐当年生枝条为外植体,对消毒方式、取材部位、植物生长调节剂及其浓度配比条件进行优化,筛选合适的诱导、增殖和生根培养基。
摘要:本研究旨在建立适于绿桐(Paulowniafortunei×Paulowniatomentosa)的快速无性繁殖技术,为试管苗工厂化生产提供技术参考。实验以绿桐当年生枝条为外植体,对消毒方式、取材部位、植物生长调节剂及其浓度配比条件进行优化,筛选合适的诱导、增殖和生根培养基。实验结果表明,最佳消毒方式为依次采用75%乙醇、等体积的10%次氯酸钠与0.1%升汞混合液、0.1%升汞消毒;当年生嫩条顶端10cm长度的茎段为最佳外植体;外植体在MS+1.0mg/L6
关键词:绿桐无性繁殖组织培养外植体不定芽
0引言
绿桐(Paulowniafortunei×Paulowniatomentosa)也叫青桐,是玄参科泡桐属(Paulownia)植物,因树皮呈绿色而得名,是由白花泡桐Paulowniafortunei与毛泡桐Paulowniatomentosa通过杂交培育出来的泡桐新品种。绿桐具有适应性强、生长迅速、成材量大、木材物理性能好、可高密度种植等优点[1
但是,绿桐无性繁殖速度慢且需要较大的人力及占地面积,导致在短期内难以获得大量优质苗木。另外,在无性繁殖过程中易造成苗木体内病毒的“累积”效应,致使丛枝病(通过种根和种苗传播)逐代加重,严重影响绿桐的生长速度和成材率。通过组织培养技术快速获得大量的绿桐组培苗,可以解决当前在种植区苗木带菌率高、病害随繁殖材料传播蔓延等问题,满足当前市场需求。有关泡桐属其他树种的组织培养研究较多,如范国强等对白花泡桐的愈伤诱导[5]及体细胞胚诱导[6
孔德广等[10]采取温度处理组培苗后结合茎尖培养脱去植物菌原体的脱毒方法,既能保证种苗无病,又能保持泡桐原来的优良特性。田国忠等以泡桐成年树上茎段为外植体,获取再生植株,并结合茎尖培养方法进行脱毒试验[11],同时还对泡桐组培脱毒苗和规模化生产关键技术进行优化和完善[12,13],结果表明使用0.1%升汞(HgCl2)对外植体进行消毒(茎尖消毒7-8min,茎段消毒10-12min),消毒效果较好,且对外植体伤害较小,萌发较快,易获得无菌苗;春季营养杯苗移栽适宜时间为3月中旬至5月初,秋季移栽时间为8月下旬至10月上旬。杨晨星等[14]对大岩桐外植体消毒进行研究,结果显示10%H2O2消毒处理,外植体污染和褐化率较高;消毒效果较好的2个组合为75%乙醇30s+0.1%HgCl2消毒10min和75%乙醇30s+5%NaClO消毒10min,该研究为其他类似植物外植体消毒提供参考。江香梅等[15]以“桐优1”等3个泡桐品种的叶片、茎段、根萌条为外植体材料进行诱导试验,结果发现根萌条是建立泡桐无菌体系的理想材料。
苏江等[16]建立白花泡桐的组织培养技术,认为最佳培养基如下:初代诱导培养基为MS+2.0mg/L6
但由于植物组织培养存在种属特异性,不同种属之间差别很大[17],因此不同泡桐优良单株的最优组培脱毒技术和方法也不尽相同[18]。另外,幼苗从生根到室外移栽成活率极低,因此需要对绿桐组织培养技术进一步研究。目前有关绿桐组织培养的研究还鲜有报道,加之市场上绿桐组培苗供应量小,价格奇高(每株高达几十元),完全满足不了市场需求。因此,本研究拟建立绿桐快繁技术体系,通过对外植体消毒方式、不定芽诱导及增殖继代、组培苗生根及室外移栽等因素进行系统性研究,为工厂化生产绿桐组培苗提供技术参考。
1材料与方法
1.1材料
供试材料绿桐1号由广西瑞谱生物科技有限公司提供,选取当年生嫩枝或从大树旁长出的嫩枝作为外植体,取材期为2018年4月。所用琼脂,蔗糖,MS培养基所需的微量元素、大量元素,有机物试剂,以及植物生长调节剂如6
1.2方法
1.2.1外植体消毒
选取健壮的速生绿桐当年生枝条。截取前端30cm左右,剪去叶片,保留叶柄2-3cm,修整后的枝条置于加有2滴洗洁精的水中浸泡5min;流水冲洗20min,转入超净台,剪成长4-5cm且带有一个或者2个叶柄的小段,用75%酒精浸泡30s。然后分成3等份分别进行以下处理:(1)0.1%升汞浸泡8min;(2)10%次氯酸钠和0.1%升汞等体积混合,浸泡8min;(3)10%次氯酸钠和0.1%升汞等体积混合消毒处理5min,无菌水冲洗1次,然后用0.1%升汞消毒3min。最后分别用无菌水冲洗3次后待用。每个处理10瓶,每瓶接种10个外植体,外植体得率(%)=无污染外植体数/外植体总数×100%。
1.2.2植物生长调节剂及其用量对腋芽萌发的影响
将消毒外植体(茎段)两端各斜切小部分并除去叶柄,然后接种于含有不同浓度6
2结果与分析
2.1消毒方法对绿桐外植体污染及腋芽萌发的影响
消毒处理方式及消毒时间对外植体污染及腋芽萌发有显著影响:消毒剂毒性过大或消毒时间过长,腋芽萌发慢甚至不萌发;消毒剂毒性过小或时间过短,外植体灭菌不彻底,污染率过高。从表1可以看出,不同消毒方式处理的茎段,其萌发时间不同且茎段的颜色也会受到影响,方法(1)和(2)的萌发时间较长,外植体污染率均超过50%,且外植体颜色由最初的深绿色变为浅绿色,有的甚至变为棕色,说明消毒对外植体伤害较大;方法(3)处理过的茎段得率最高为62%,且腋芽萌发时间也最短(12d),说明此消毒方法最有效,且对外植体毒害较小,保证了外植体的成活和诱导效果。因此,消毒方法(3)适用于绿桐茎段的消毒。
2.2植物生长调节剂对不定芽诱导的影响
在含不同植物生长调节剂的MS培养基上,茎段腋芽萌动及长势差异明显(表2)。MS培养基中的生长调节剂为1.0mg/L6
3讨论
3.1消毒方式对绿桐外植体消毒效果影响
获得无菌外植体是植物组织培养成功的必要前提,常通过化学药剂如酒精、升汞、次氯酸钠等对植物材料表面进行消毒,不同消毒方式对植物的伤害和消毒机理不同,消毒剂及消毒时间对植物外植体的消毒效果、存活率及出芽率有显著影响[5]。为降低对外植体的伤害且达到消毒目的,通常将消毒剂组合使用。另外,消毒时间过长对外植体的毒害作用较大,会褐化外植体或者直接将其杀死,进而使腋芽无法萌发,无法建立组培体系;若消毒时间过短,则无法获得无菌外植体[19]。
田国忠等[12]研究发现,酒精对泡桐外植体伤害较大,消毒剂可以只用0.1%升汞,但污染率偏高。本研究在借鉴前人经验的基础上,对绿桐消毒方式进行研究,结果发现:只是用酒精,消毒效果较差且容易褐化,这与前人研究结果一致[11,18];当使用3种消毒剂组合(先用75%酒精消毒后,再用10%的次氯酸钠与0.1%升汞等体积混合液消毒,最后用0.1%升汞消毒)时,外植体污染率低于40%,且受到的伤害最小,易于腋芽萌发,这与一些文献报道结果类似[14]。
3.2植物生长调节剂在绿桐组织培养中的作用
植物生长调节剂的组成及浓度对离体组织的诱导、增殖及生根等生长发育起关键作用[20]。其中细胞分裂素可引起细胞分裂并诱导芽的萌发和生长,生长素则促进植物细胞伸长和根系分化。在特定范围内,外植体芽的诱导、增殖及根的分化由细胞分裂素与生长素的种类和浓度决定[21]。
3.3绿桐组培苗移栽
植物组培苗的炼苗和移栽是快繁体系最后一个核心环节。移栽成活率的高低直接影响组培快繁的生产成本[23]。组培苗不经过炼苗直接进行移栽,由于植株过于幼嫩,移栽后易引起烂根死亡,影响幼苗的成活率[24]。基质的选择、灭菌及移栽后的保温、保湿等措施对苗的成活也起到重要作用。试管苗比较幼嫩,从无菌转入有菌环境生长,如果没有灭菌、保湿等保护性措施就很难抵御外界杂菌的侵染及干燥等复杂环境,容易染菌或干枯死掉,所以移栽前必须做好基质的消毒及移栽后的覆膜保温、保湿等工作[25]。本实验中,先对绿桐组培苗炼苗7d后再进行移栽,移栽后用地膜覆盖保湿,组培苗成活率可达92%。
生态植物论文投稿刊物：《应用生态学报》(月刊)创刊于1990年，是中国科学院主管、中国生态学学会和中国科学院沈阳应用生态研究所联合主办的综合性学术期刊，创刊于1990年，由科学出版社出版。本刊主要报道应用生态学领域的创新性科研成果与科研进展，反映我国应用生态学的学术水平和发展方向，跟踪学科发展前沿，注重理论与应用结合，促进国内外学术交流合作与人才培养。
4结论
本研究对绿桐外植体消毒方式、诱导分化及炼苗条件进行实验,结果表明:最佳消毒方式为依次采用75%乙醇、等体积10%次氯酸钠与0.1%升汞混合液、0.1%升汞消毒;选择当年生嫩条顶端10cm长度的茎段为最佳外植体;外植体在MS+1.0mg/L6
参考文献
[1]温远光.桉树生态、社会问题与科学发展[M].北京:中国林业出版社,2008.
[2]李国雷,刘勇,于海群,等.油松(Pinustabulaeformis)人工林林下植被发育对油松生长节律的响应[J].生态学报,2009,29(3):1264
作者：张红岩1,2,莫勇生1,欧娜1,谢唯1,申乃坤2
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