西瓜果实形状的分子精准鉴定

　　摘要：为了实现西瓜果实形状的分子精准鉴定，利用“国家西瓜甜瓜中期库”的资源和高通量测序平台，利用两个不同的杂交分离群体(F2和BC1P1)分别鉴定到一个159bp插入缺失和一个非同义SNP导致的果形突变(由圆果形变为长果形)，且SNP突变在159bp插入缺失的基因组区域内。利用这个SNP开发CAPS标记Markersun在两个群体和28份西瓜种质中进行分析，发现标记Markersun在两个群体中与果形表型共分离;在西瓜种质中可同时区分插入缺失和SNP的变异，且与果形表型共分离。同时这两个变异与果形的共分离在196份西瓜核心种质的基因型分型中也得到验证。此外，通过对不同类型西瓜种质的基因型分析发现，SNP变异导致的长果形出现的时间更早且独立遗传，而159bp插入缺失引起的长果形是栽培西瓜驯化过程中产生的。本研究首次利用不同类型的西瓜核心种质实现了西瓜果形的分子精准鉴定，还挖掘到两个西瓜果形的功能变异并开发标记，为西瓜果形的分子精准鉴定提供技术支撑，同时为果形性状基因功能验证提供靶标，加速了西瓜果形性状基因的调控机理研究。

　　关键词：西瓜;果形;功能分子标记;核心种质;精准鉴定

　　果实形状是瓜果类园艺作物的重要性状，同时也是产品分类、定级与评价的重要指标。前人研究发现番茄的果形主要由个基因SUN、OVATE、LOCULENUMBER(LC)和FASCIATED(FAS)调控(Rodriguezetal.，2011;Monforteetal.，2014)，黄瓜和甜瓜中与控制番茄果形的SUN同源的基因CsSUM和CmSUN14也是控制果形的关键基因(Panetal.，2017)。

　　西瓜种植论文范例：小兰西瓜早春无公害设施栽培技术

　　西瓜果实形状有圆形和非圆形(椭圆和长)，受显性单基因控制(Weetman，1937;Poole&Grimball，1945)。受环境及栽培条件影响，椭和长的界限模糊，难以区分，但圆与二者的区别很大，因此笔者在本文中将椭圆和长统称长。前人利用不同遗传背景的西瓜材料在号染色体的相同区域稳定检测到一个果形主效QTL(Sandlinetal.，2012;Liuetal.，2016;Douetal.，2018;Guoetal.，2019;Legendreetal.，2020)，并在QTL区域发现SUN的同源基因Cla011257。同时开发了一些分子标记，包括个InDel(Douetal.，2018)和个SNP(Legendreetal.，2020)。

　　因所用的材料有限，有关西瓜果形的关键遗传变异和遗传进化至今尚不清楚。分子标记辅助选择是利用与目标性状基因紧密连锁或表现共分离的分子标记进行选择的一种方法，但由于分子标记与目的基因之间的连锁不够紧密使得遗传交换在所难免，性状预测的准确率难以达到预期(Fuetal.，2017);并且育种中常用的分子标记大多位于基因间非表达序列，无法区别与其连锁基因的表达序列的差异。而功能分子标记源于控制目标性状基因的功能变异(Kageetal.，2016)，对基因的选择更为有效，并且功能标记的应用还可以更好地避免连锁累赘，减少供体不利基因向受体导入。

　　功能分子标记已在一些作物，如水稻(Jietal.，2010;Zhouetal.，2013)、小麦(Periyannanetal.，2014)、玉米(Azmachetal.，2013)、大豆(Liuetal.，2014)等得到应用，但园艺作物的功能分子标记甚少。为挖掘影响西瓜果形的功能变异并实现果形性状的分子精准鉴定，本研究结合深度重测序和简化基因组测序，利用不同类型的西瓜骨干亲本构建和BC分离群体，分别定位西瓜果形性状的QTL并挖掘关键的遗传变异，开发标记并在群体和核心种质中进行验证，为西瓜果形分子标记辅助育种提供技术支撑，同时加速西瓜果形性状基因的调控机理研究。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料与群体构建

　　用于基因定位的第套群体是利用圆果形栽培西瓜品系‘ZXG01478’为母本，长果形栽培西瓜品系‘14CB11’为父本，杂交获得，进一步自交获得含有93个单株的群体(Shangetal.，2016);父母本、和群体的各个单株在2013年秋季种植，分别自交留种并于成熟期调查果实形状等数据。第套群体是利用圆果形栽培西瓜品系‘B100’为母本，长果形栽培西瓜品系‘B136’(已验证与长果形西瓜品系‘14CB11’不同)为父本，杂交获得，进一步与母本‘B100’回交获得含有93个单株的BC群体;父母本、和BC群体各单株在2017年春季种植，分别自交留种并于成熟期调查果实形状等数据。另有调查鉴定果形的128份西瓜种质(李娜等，2020)包括份缺须西瓜、份药西瓜、30份野生西瓜、21份黏籽西瓜和69份普通西瓜。所有材料均按常规方法种植。

　　1.2性状调查与数据分析

　　果实形状、果实长度、果实宽度、果形指数的性状调查方法参照项目组的标准方法进行(李娜等，2020)。卡方测验和相关性分析分别利用SASV8的Freq和corr程序进行。

　　1.3QTL定位与连锁分析

　　利用包含2634个SNP标记的遗传连锁图谱(Shangetal.，2016)和表型数据进行QTL定位。QTL扫描采用WinQTLcartographer2.5软件(http：//statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)的复合区间作图法(compositeintervalmapping，CIM)。基于标准模型Model6，余因子的选择采用前后回归相结合(forwardbackwardstepwiseregression)的方法(Pin=0.05和Pout=0.05)。

　　背景标记数、窗口大小、扫描间距和运行速度分别设为、10cM、5cM和1cM。QTL显著性的阈值用1000次的排布测验(Churchill&Doerge，1994)确定。采用=0.05的显著性水平来确认QTL。新开发的分子标记和连锁群上其他SNP标记运用JoinMap4.0软件(http：//www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap)构建遗传连锁图谱。软件参数设置：拟合度阈值≤，最大重组率0.4，最小LOD为2.0，作图函数选择Kossambi函数。

　　1.4标记开发

　　对个亲本材料利用IlluminaHiSeqTM2500进行约20×深度的重测序，参考基因组为全基因组测序的西瓜品种‘97103’(Guoetal.，2013)。SNP和InDel的检测主要使用GATK软件工具包(McKennaetal.，2010)实现。利用自编的Perl程序提取插入缺失相应位置前后500bp的序列。利用Primer5.0软件(Clarke&Gorley，2001)设计对应InDel的引物对。利用在线分析软件dCAPSFinder2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)(Neffetal.，2002)和Oligo7软件设计CAPS引物(SNP转化)并选择常用价廉的限制性内切酶。

　　1.5基因型鉴定与数据分析

　　西瓜叶片的DNA提取采用改良的CTAB方法，PCR的扩增按照常规方法进行，对PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。PCR产物直接利用其引物由北京六合华大基因科技有限公司进行Sanger测序。重测序数据的直观查看利用IGV(IntegrativeGenomicsViewer)软件包。

　　2结果与分析

　　2.1西瓜果实形状基因定位

　　群体的母本‘ZXG01478’为圆果形，果实长度、果实宽度、果形指数分别为(17.25±0.35)cm、(16.50±1.13)cm、1.05±0.05。父本‘14CB11’为长果形，果实长度、果实宽度、果形指数分别为(26.00±1.50)cm、(16.17±1.04)cm、1.61±0.07。趋向于长果形，果实长度、果实宽度、果形指数分别为(25.55±1.48)cm,(17.00±1.84)cm、1.51±0.08，更接近于父本。群体93个单株的果实长度、果实宽度和果实指数的频率分布图呈现正态或近似正态分布。群体中长果形的70个，圆果形的23个，基本符合3:1的分离比(χ=1.04，=0.31)，表明果形受个显性基因控制。相关性分析表明，果实长度与果形指数显著正相关(r=0.91，<0.0001)，果实宽度与果形指数呈现负相关(r=–0.45，<0.0001)，而果实长度和果实宽度无显著的相关性(r=–0.07，=0.534)。

　　2.3西瓜种质果实形状的精准鉴定

　　利用Markersun的引物在128份西瓜种质中进行PCR扩增，并用限制性内切酶TagI进行酶切。可以明确显示159bpInDel和SNP的变异。主带有种带型，259bp(，果形为长)，151bp和108bp两条带(，果形为圆)，100bp(，果形为长)，且存在AB、BC的杂合带，表型皆为长果形，与果形的显性基因结果一致。标记Markersun在种质中的基因型鉴定结果与表型性状(表)完全吻合。

　　利用项目组进行的196份西瓜核心种质(本试验所用128份包含在内)重测序获得的SNP变异发现，有159bp缺失的长果形种质在号染色体的26847041bp位置为缺失(未知序列)，而其他的种质基因型分为两类，即参考基因组基因型和突变SNP基因型，且与果实形状表型完全共分离，这与利用标记Markersun分析的结果完全一致。

　　查考候选基因Cla011257及其上、下游5kb的基因组区域的SNP和小的InDel，除了这个SNP(Chr6：26847041)，其他的变异与果实形状皆无显著的相关性。因此，推测这个SNP和159bpInDel都可导致候选基因Cla011257功能发生改变从而使西瓜果形由圆变为长。

　　野生西瓜中的长果形西瓜全部是SNP变异引起;而普通西瓜中的长果形部分是SNP变异引起，部分是159bpInDel引起，说明SNP变异导致的长果形出现的时间更早并独立遗传，而159bpInDel引起的长果形西瓜是栽培西瓜驯化过程中产生的。

　　3讨论

　　Cla011257属于SUN基因家族成员，是西瓜果形的候选基因(Douetal.，2018;Legendreetal.，2020)。已有研究表明，SUN在其他园艺作物中控制果实长度和果形，如番茄、甜瓜和黄瓜(Xiaoetal.，2008;Monforteetal.，2014;Perpinaetal.，2016;Panetal.，2017)等。

　　Dou等(2018)发现长果形的西瓜候选基因Cla011257存在个159bp的缺失，导致53个氨基酸的缺失，可能导致其功能发生改变，开发的InDel标记在分离群体中得到验证。Legendre等(2020)利用份不同果形的西瓜材料，对候选基因Cla011257进行测序和变异分析，发现个159bpInDel和个SNP，并开发KASP标记在分离群体中进行验证。上述研究仅在几份不同果形材料及其后代分离群体中进行验证，有限的资源数使得对西瓜果形的进化和驯化难以窥见全貌。

　　本研究中，首先针对性的构建果形相关群体，挖掘与果形性状相关的候选基因和关键遗传变异。值得关注的是，在果形基因Cla011257的第个外显子区域发现个159bpInDel和一个非同义SNP在两个群体中分别与表型共分离。利用128份西瓜种质对开发的功能分子标记进行验证，标记基因型和果形表型完全共分离。全部196份西瓜核心种质的重测序结果也证实这个SNP和InDel共同解释核心种质100%的表型变异。

　　在资源繁殖更新和数据调查过程中发现，搜集到的有限几份野生近缘种诺丹西瓜、缺须西瓜、热迷西瓜、药西瓜都是圆果形，半野生种质黏籽西瓜全部是圆果形，而野生西瓜和现代栽培种质既有圆果形，又有长果形。通过分析发现，野生西瓜种质中的长果形全部是SNP突变导致，而现代栽培西瓜中的长果形部分是SNP突变导致，部分是159bp的缺失导致。因此推测，这个SNP在早期进化时期出现并在驯化的过程中独立遗传，而159bpInDel在栽培西瓜的驯化过程中出现。

　　至此，推测位于候选基因Cla011257第个外显子上的这个非同义点SNP突变和159bpInDel皆可导致基因功能发生改变从而使得果形由圆形变为长形。本研究通过西瓜分离群体和核心种质的分析，获得两个独立遗传的功能变异(个SNP和个InDel)与果形性状共分离，基本实现了西瓜果形的分子精准鉴定，为西瓜果形的定向育种提供技术支撑和理论指导，并为后续关键变异和功能基因的验证提供靶标，加速了果形性状基因的调控机理研究。

　　作者：李娜，尚建立，李楠楠，周丹，孔胜楠，王吉明，马双武

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