谷氨酸棒杆菌的代谢工程使能技术研究进展

　　摘要:谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum是重要的工业微生物，尤其是在氨基酸工业中，每年用于600余万t氨基酸的生物制造。近年来，谷氨酸棒杆菌代谢工程使能技术正在不断完善，不仅加快了细胞工厂的创建和优化，拓展了底物谱和产物谱，也推动了谷氨酸棒杆菌的基础研究，使谷氨酸棒杆菌成为代谢工程的理想底盘细胞。文中综述了近期针对谷氨酸棒杆菌开发的代谢工程使能技术，着重介绍了基于CRISPR的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化和生物传感器等技术的开发和应用。

　　关键词:谷氨酸棒杆菌，代谢工程，基因组编辑，表达调控，适应性进化，生物传感器

　　谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum是一株来源于土壤的革兰氏阳性细菌。20世纪50年代，日本协和发酵工业株式会社首次开发了谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的工艺，展示了该菌在氨基酸工业生产中的巨大潜力[1]。目前，谷氨酸棒杆菌每年被用于生产包括L-谷氨酸和L赖氨酸在内的600余万t氨基酸产品[2]。

　　由于具有生物安全(被美国FDA认定为GRAS，Generallyregardedassafe)、生长速度快、营养需求低、底物谱广等优势，谷氨酸棒杆菌被认为是生物制造的理想微生物底盘[3]。由于谷氨酸棒杆菌的重要应用价值，大量研究致力于开发可用于该微生物遗传改造的工具方法。20世纪90年代初，研究者建立了谷氨酸棒杆菌的外源DNA转化方法，使用基于自杀质粒的同源重组和转座子插入等方法，实现了基因组的改造。

　　21世纪初，德国和日本的研究人员分别公布了模式菌株ATCC13032的全基因组序列，为 深入理解和系统改造谷氨酸棒杆菌奠定了基础[4]。代谢工程概念的提出，转变了研究人员长期依赖诱变筛选策略获得新菌种的育种模式，转而用更理性的方式对谷氨酸棒杆菌的代谢和调控网络进行改造和重构，极大地加速了谷氨酸棒杆菌的应用和基础研究[5]。目前谷氨酸棒杆菌已被改造用于氨基酸、有机酸、醇类、植物天然产物、蛋白质等70余种产品的生物制造，产值超过千亿元[2,6]。文中总结了针对谷氨酸棒杆菌开发的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化、生物传感器等代谢工程使能技术，并概述了这些使能技术在创建谷氨酸棒杆菌细胞工厂中的应用。

　　1基于CRISPR的基因组编辑

　　CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein)系统已广泛应用于多种真核和原核生物的基因组编辑[7]。但该系统对谷氨酸棒杆菌的毒性较大，直至2017年，CRISPR/Cas12a(CRISPR/Cpf1)和CRIPSR/Cas9系统才成功应用于谷氨酸棒杆菌的遗传改造[8-10]。借助CRISPR/Cas系统的高效反筛能力，大片段基因敲除和敲入效率得到提高，操作流程得到简化[10]。进一步结合RecT介导的单链DNA重组[10-12]和碱基脱氨酶催化的胞嘧啶/腺嘌呤脱氨[13-15]，还可实现染色体的小幅改动和多靶点同时编辑，极大地丰富了谷氨酸棒杆菌的遗传改造方法，为谷氨酸棒杆菌的代谢工程和合成生物学研究提供了技术支持。

　　1.1基因敲除和敲入

　　敲除内源基因和敲入异源基因是重构微生物代谢和调控的基本策略。基于自杀质粒pK18mobsacB的经典方法已经广泛应用于谷氨酸棒杆菌的基因敲除和敲入，几乎可以在染色体任何位置进行遗传改造[16]。但是，该方法需要进行两轮同源重组和两轮筛选，分别使用抗生素抗性基因和蔗糖致死基因sacB作为筛选标记，后者易被失活，导致反向筛选失效;尤其在敲除对生长造成负面影响的基因时，成功率较低。

　　借助CRISPR/Cas系统，可实现更高效的反向筛选，从而富集被成功编辑的细胞。该方法的原理为，在未编辑的细胞中，Cas蛋白在引导RNA(GuideRNA，gRNA)的引导下，通过识别PAM(Protospaceradjacentmotif，PAM)序列和靶序列，结合到特定位点，并引入对细菌致死的双链DNA切割(Double-strandedDNAbreak，DSB);而在成功编辑的细胞中，靶位点被改变，因此Cas-gRNA复合体无法结合并引入DSB，细胞得以存活[17]。

　　目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统为来自酿脓链球菌Streptococcuspyogenes的CRISPR/Cas9系统。该系统识别NGG的PAM序列，结合特异性高，切割效率高，非常适合于高GC含量的谷氨酸棒杆菌基因组编辑。但是，研究发现，携带cas9基因的质粒难以转化进入谷氨酸棒杆菌，说明谷氨酸棒杆菌对Cas9造成的细胞毒性较为敏感[9]。Jiang等使用新凶手弗朗西斯菌Francisellanovicida的FnCas12a代替Cas9进行基因组编辑。Fncas12a和gRNA的表达盒，以及同源重组所需DNA模板可整合在一个工具质粒上，利用该系统，作者实现了最长7.5kb的片段敲除，效率最高达到(46.7±9.4)%[9]。但是，FnCas12a识别富含T的PAM序列TTTN，这导致其在高GC含量的谷氨酸棒杆菌基因组中的靶位点数量受限。

　　与此同时，Liu等和Peng等分别开发了适用于谷氨酸棒杆菌的CRISPR/Cas9系统，实现了高效的大片段敲除和敲入。两个研究均使用了双质粒系统，分别用于表达cas9和gRNA+同源臂片段[10,18]。以Liu等报道的方法为例，首先，选择严谨的Ptac启动子减少cas9的泄露表达，克服Cas9的细胞毒性;使用TrrnB终止子替代酿脓链球菌gRNA的终止子，提高gRNA转录终止效率，成功在谷氨酸棒杆菌中构建了基于CRISPR/Cas9的反向筛选系统，实现了利用质粒携带同源臂片段进行基因敲除。

　　但是，敲除过程中仍发现大量的假阳性转化子，对其中的工具质粒进行测序，作者发现cas9基因内部存在失活基因的随机突变。为降低假阳性率，开发了双质粒一步共转化结合平板筛选的策略，尽量缩短工具质粒在细胞中的复制时间，减少cas9基因突变失活的概率。该策略成功提升了基因敲除和敲入效率，在模式菌株ATCC13032中分别达到60%和62.5%，在模式菌株ATCC13869和谷氨酸工业菌株SL4中也可实现高效的编辑[10]。随后，有多个研究团队对基于CRISPR/Cas的谷氨酸棒杆菌基因敲除和敲入方法进行了系统优化，不断提升编辑效率[11,19-22]。

　　1.2单链DNA重组

　　谷氨酸棒杆菌中外源双链DNA(DoublestrandedDNA，dsDNA)模板与染色体DNA的同源重组效率较低，Binder等在谷氨酸棒杆菌中表达异源的RecT，实现了外源单链DNA(SinglestrandedDNA，ssDNA)模板与染色体DNA高效的同源重组[23]。但是当时缺乏有效的突变体筛选方法，只能借助流式细胞分选技术(Fluorescenceactivatedcellsorting，FACS)筛选具有特殊表型，如具有荧光信号输出的突变体。谷氨酸棒杆菌中CRISPR/Cas系统的建立，使得筛选ssDNA重组编辑的突变体成为可能。CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统均成功与ssDNA重组相结合，用于谷氨酸棒杆菌染色体DNA的小幅改动，编辑效率高达100%[8-10,12]。

　　使用该方法，一次可获得数百个正确编辑的克隆。因此，该方法被用于构建靶基因单个位点的突变文库。Jiang等和Krumbach等分别利用该方法构建了γ-谷酰基激酶和机械敏感通道蛋白MscCG的单氨基酸突变文库，筛选得到解除产物反馈抑制和外排谷氨酸能力增强的突变体[9,12]。ssDNA重组高效的编辑能力，使得同时编辑多个靶点成为可能。Liu等使用两条ssDNA，表达两个gRNA，结合CRISPR/Cas9筛选，成功实现了双基因的同时编辑，效率达到40%。但是，双靶点编辑使获得的克隆数大幅下降(约10个)，难以进行更多靶点的同时编辑[10]。

　　1.3碱基编辑

　　上述基因组编辑方法均基于dsDNA或ssDNA模板与染色体DNA的同源重组，以及CRISPR/Cas系统对未发生同源重组细胞的反向筛选。但是，一方面谷氨酸棒杆菌的同源重组效率较低，另一方面，具有dsDNA切割活性的Cas蛋白对细胞的毒性较强，导致被成功编辑的细胞数量较少，难以实现多于2个靶点的同时编辑[10]。基于以上考虑，新兴的碱基编辑(Baseediting)技术被应用于谷氨酸棒杆菌的基因组编辑[13-15]。

　　Komor等和Nishida等分别于2016年开发了真核细胞的BE(Baseeditor)和Target-AID(Targetactivation-inducedcytidinedeaminase)碱基编辑技术[24-25]。该技术将CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的脱氨功能相结合，使用dsDNA切割功能受损的Cas突变体(dCas或nCas)与碱基脱氨酶的融合蛋白，在gRNA的引导下，将靶位点的胞嘧啶(C)脱氨生成尿嘧啶(U)，U在DNA复制过程中被DNA聚合酶识别为T，借此实现靶位点C−T的碱基转换(Transversion)。之后，研究者陆续开发了可实现A−G转换、C−A颠换(Transition)和C-G颠换的碱基编辑技术[26-28]。

　　2基因表达调控

　　2.1启动子与RBS元件

　　调控基因的表达水平是常用的代谢工程策略。使用具有不同强度的启动子和核糖体结合位点(Ribosomebindingsite，RBS)，可分别在转录和翻译水平对靶基因的表达水平进行精细的调控。Albersmeier等通过对谷氨酸棒杆菌的转录起始位点进行系统的分析，鉴定了大量内源的启动子，为进一步的启动子表征和应用奠定了基础[32]。

　　Shang等对16个内源启动子进行了表征，这些启动子可覆盖31倍的表达强度，利用它们调控sucCD的表达，可提高L-赖氨酸的产量[33]。Li等基于RNA测序数据，对谷氨酸棒杆菌中90个200−500bp的启动子-5′-UTR序列进行了表达强度表征，鉴定了比常用组成型启动子Psod-UTR强5倍的启动子PNCgl1676-UTR，以及受L-甲硫氨酸激活的启动子PbrnF-UTR和受L-赖氨酸抑制的启动子PNCgl1202-UTR[34]。

　　王迎春等基于时间序列转录组筛选到谷氨酸棒杆菌高效的内源组成型启动子PcysK、PgapA和PfumC，其中最强的PcysK启动子在部分测试菌株中强于IPTG诱导型启动子Ptac[35]。除内源启动子外，研究者还开发了大量适用于谷氨酸棒杆菌的异源和合成启动子。例如，Kortmann等将来自于大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)的T7表达系统转移至谷氨酸棒杆菌，实现了靶基因的严谨可控和高水平的表达[36]。

　　Yim等利用70bp的随机序列构建了一个合成启动子文库，使用绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)作为报告基因，结合FACS筛选获得20个具有不同强度的组成型启动子元件，荧光强度介于100至1200间[37]。Patek等基于谷氨酸棒杆菌启动子−10区保守序列和大肠杆菌−35区保守序列，并在−35区上游添加一段额外的富含AT的序列，构建了4个组成型启动子文库。此外，作者还以大肠杆菌的lac启动子为基础，对−35区和−10区间的17bp进行随机突变，构建了一个诱导型启动子文库，诱导强度范围为7−59倍[38]。

　　2.2CRISPR干扰

　　当需要抑制细胞生长必需基因，或者需要研究大量靶基因的表达弱化对细胞生长和代谢的影响时，对靶基因进行编辑将非常困难，且耗时耗力。因此，需要方便、高效的基因表达弱化工具。CRISPR干扰(CRISPRinterference，CRISPRi)技术是使用DNA切割功能失活的Cas突变体(CatalyticallyinactivatedCas，dCas)，在gRNA的引导下，结合到靶基因位置，影响RNA聚合酶的结合，从而抑制靶基因的转录[48]。

　　Cleto等最先在谷氨酸棒杆菌中开发了基于CRISPR/dCas9的CRISPRi方法。该方法使用双质粒系统和IPTG诱导型启动子Ptac控制dCas9和gRNA的表达，以pgi、pck和pyk作为靶基因，当靶向基因的非模板链时，弱化效率均可达到97%以上，可获得与基因敲除相似的L-赖氨酸和L-谷氨酸产量提升效果[6]。

　　Park等同样使用了类似的双质粒系统，分别以四环素诱导型启动子和组成型启动子控制dCas9和gRNA的表达，并通过同时表达两个gRNA，实现了双基因的表达弱化[49]，作者使用该方法快速鉴定了谷氨酸棒杆菌中未知的羧酸酯酶编码基因[50]。该研究团队随后构建了一个单质粒的CRISPRi系统，并在基因工程谷氨酸棒杆菌中通过弱化acn基因提高了丁酸产量[51]，通过弱化idsA基因提高了角鲨烯产量[52]。Gauttam等同样构建了一个单质粒CRISPRi系统，但是分别使用四环素和IPTG诱导型启动子控制dCas9和gRNA的表达，也可用于双基因的同时弱化[53]。

　　3适应性进化

　　新型的基因组编辑与基因表达调控技术提高了研究人员对谷氨酸棒杆菌的代谢改造和调控能力。但是对于一些遗传靶点未知或代谢调控机制复杂的生物学表型，难以通过理性的遗传改造实现。适应性进化技术在此方面有独特的优势，已被广泛应用于提高谷氨酸棒杆菌的生长速度、压力耐受性和底物利用能力等，在提高小分子化合物的合成能力方面也展现出应用潜力[57]。

　　3.1直接适应性进化

　　在特定条件下直接对菌株进行适应性进化是最常用的进化方法，适合于提高菌株的生长速度和压力耐受性等。生长速度是菌株的一个关键指标，对于代谢工程应用十分重要。多个团队尝试提高谷氨酸棒杆菌在基本培养基中利用葡萄糖的生长速度[58-60]。例如，Pfeifer等通过适应性进化，将谷氨酸棒杆菌的比生长速率提高至0.67h−1，较出发菌株提高了26%，并鉴定了pyk、fruK和corA等基因的关键突变[59]。Graf等在不含原儿茶酸的培养基中对谷氨酸棒杆菌进行进化，筛选获得了可在不含原儿茶酸的基本培养基中快速生长的突变株，比生长速度达到0.54h−1[61]。

　　4生物传感器

　　生物传感器是一种将生物物质浓度转化为电信号、荧光信号等易于检测的信号的装置，包含信号识别元件和信号输出元件，可辅助适应性进化，加快进化过程，还可用于高通量筛选、代谢途径的优化与动态调控、细胞成像等。常用的生物传感器主要包括基于转录调控因子(Transcriptionfactor，TF)、核糖体开关(Riboswitch)和蛋白质相互作用(例如荧光共振能量转移Försterresonanceenergy transfer，FRET)的生物传感器(表1)[71]。最近，研究者还开发了基于稀有密码子的新型生物传感器，并应用于氨基酸生产菌的高通量筛选[72]。

　　5总结与展望

　　新型的基因组编辑、基因表达调控、适应性进化、生物传感器等代谢工程和合成生物学使能技术的快速发展，显著加快了谷氨酸棒杆菌细胞工厂的构建和优化。

　　生物基因研究论文投稿刊物：《生物工程学报》(月刊)1985年创刊，杂志是国内外公开发行的全国性学术期刊,由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。

　　基于此，谷氨酸棒杆菌仍是氨基酸生物制造的核心菌种，在其他大宗化学品、生物燃料、天然产物、蛋白质等产品的生物制造中，也扮演着越来越重要的角色。但是，与另外两个常用的底盘微生物大肠杆菌和酿酒酵母Saccharomycescerevisiae相比，谷氨酸棒杆菌的多基因或多靶点编辑工具仍需提升，缺乏MAGE(Multiplexautomatedgenomeengineering)[94]或eMAGE(EukaryoticMAGE)[95]等在染色体上直接产生遗传多样性的高效技术。

　　另一方面，谷氨酸棒杆菌基因组的3000余基因中仍有超过40%的基因功能未知或缺乏实验证据。因此，为更好地挖掘谷氨酸棒杆菌的代谢潜力，进一步提升生物制造的效率，需要进一步优化代谢工程使能技术，结合自动化实验装备，进行高通量的功能基因组研究，解析谷氨酸棒杆菌优良生物学和工业性状背后的遗传和分子机制。另一方面，亟需完善谷氨酸棒杆菌的代谢模型和调控网络，为菌株构建和优化提供更精确的预测和设计。

　　REFERENCES

　　[1]SanoC.Historyofglutamateproduction.AmJClinNutr,2009,90(3):728S-732S.

　　[2]BeckerJ,RohlesCM,WittmannC.MetabolicallyengineeredCorynebacteriumglutamicumforbio-basedproductionofchemicals,fuels,materials,andhealthcareproducts.MetabEng,2018,50:122-141.

　　[3]ZhaoN,QianL,LuoG,etal.SyntheticbiologyapproachestoaccessrenewablecarbonsourceutilizationinCorynebacteriumglutamicum.ApplMicrobiolBiotechnol,2018,102(22):9517-9529.

　　[4]BeckerJ,WittmannC,Industrialmicroorganisms:Corynebacteriumglutamicum,in:WittmannC,LiaoJC,eds.IndustrialBiotechnology:Microorganisms,Wiley-VCHVerlagGmbH&Co.KgaA,2016:183-220.

　　[5]龙梦飞,徐美娟,张显,等.合成生物学与代谢工程在谷氨酸棒杆菌产氨基酸中的应用.中国科学:生命科学,2019,49(5):541-552.

　　作者：王钰1,2，郑平1,2，孙际宾1,2

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