本文摘要：摘要：石油污染改变土壤微生态环境，驱动了土壤微生物群落结构的演替与进化.为了深入探究油田区油污土壤中微生物群落分布特征，揭示区域性的土壤微生物群落结构成因，采用Miseq平台的16SrDNA扩增子测序技术分析了辽河油田和大庆油田区6组共计18个土壤样品的微生物群落
摘要：石油污染改变土壤微生态环境，驱动了土壤微生物群落结构的演替与进化.为了深入探究油田区油污土壤中微生物群落分布特征，揭示区域性的土壤微生物群落结构成因，采用Miseq平台的16SrDNA扩增子测序技术分析了辽河油田和大庆油田区6组共计18个土壤样品的微生物群落多样性及结构组成，并结合土壤环境因子指标剖析了群落结构成因，进而预测了具有石油代谢能力的功能菌属.结果表明，石油含量随着距井口距离增加而减少，石油的空间分布特征是影响微生物群落结构变化的关键因子，6组土壤样品的OTU分属于49门、131纲、169目、328科和564属，微生物种群多样性随着污油浓度的增加而减小;两油田共有5个相同优势菌门，2种优势菌属;辽河油田区独特优势菌门为Saccharibacteria门，优势菌属为微枝形杆菌属(Microvirga)、分支杆菌属(Mycobacterium)和Defluviicoccus属;大庆油田独特优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)，独特优势菌属包括盐单胞菌属(Halomonas)、食烷菌属(Alcanivorax)和海杆菌属(Marinobacter)等.冗余分析(RDA)结果表明污油组成是微生物群落差异性分布的决定性因素，胶质的高含量与强毒性诱导辽河油田区微生物群落获得较强的胁迫抗性;同时区域生态环境背景差异也是影响微生物群落整体胁迫抗性的重要因子.结合PICRUSt分析预测，共发现2种辽河油田区和5种大庆油田区石油功能降解优势菌属，为石油降解功能菌剂的种质资源的高效开发提供目标菌株.
关键词：油田土壤;微生物群落;环境因子;污油组成;高通量测序
1引言(Introduction)
陆上石油开采区土壤普遍存在石油污染，由于微生物的种群特征受底物种类和浓度的影响，导致土壤微生物群落发生不同程度的变化.石油作为特征污染底物，其侵入土壤中会封闭土壤孔隙，进而影响土壤含氧量，使得好氧微生物活性降低，同时石油类污染物会影响土壤酶活性，影响微生物的代谢能力，有些微生物可以利用石油烃作为碳源迅速生长，而有些微生物由于石油的毒害作用生长受到抑制，从而影响了土壤微生物群落的丰度和多样性(王梅等，2010;Khanetal.，2018;张泽霆等，2019;Koshlafetal.2019;徐春燕等，2020).
Gao等(2015)对黄河三角洲石油污染土壤的研究发现，土壤中微生物多样性与石油烃浓度呈正相关，放线菌门、厚壁菌门和栖热菌门是该区域的优势菌群.Nakatsu等(2007)研究发现，土壤中微生物多样性与多环芳烃浓度呈负相关，石油污染使得油井周边土壤中的优势菌群发生了改变.甄丽莎等(2015)研究发现，黄土高原土壤微生物多样性会随着石油含量的增加而降低，其原因在于一定浓度的石油污染可以刺激土壤微生物群落中具有石油污染物降解能力的优势种群的生长，而对其耐受性较差的微生物种群生长受到抑制被逐渐淘汰.
由此可见，石油对土壤的污染过程造就了差异化的土壤微生物群落特征，并提供了潜在的特异性种质来源.针对土壤微生物群落特征的分析，已有研究多采用磷脂脂肪酸(PLFA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、醌指纹和高通量扩增子测序等技术，其中PLFA法通过分析微生物细胞结构的稳定组分(PLFA)的种类及组成比例来鉴别土壤微生物结构多样性，但PLFAs并不能与土壤微生物物种一一对应，且总体种类较少(姚晓东等，2016);DGGE法通过分析差异化的16SrDNA碱基序列揭示微生物细菌群落结构组成，但由于其分离DNA片段大小限制在100～500bp，故分析序列量非常有限(马悦欣等，2003);醌指纹法通过环境中微生物醌的组成来反映微生物群体组成，但其不能反映到属水平(胡洪营等，2002).
随着现代分子生物学研究的发展，第二代测序(nextgenerationsequencing，NGS)技术因其具有低成本、高通量、速度快、精度高等优点，已被广泛应用于土壤微生物组成特征分析(张春兰等，2012;郭魏等，2017;施昊坤等，2020).顾磊等(2017)应用高通量测序技术研究了玉北油田油气富集带微生物的丰度、分布和群落结构等特征，并鉴定出假单胞菌属、芽孢杆菌属和土壤杆菌属是该区域利用烃类兼性生长的优势微生物.
杨琴等(2015)应用高通量测序技术对长庆油田石油污染土壤的石油降解菌群研究发现，该区域检测到包括变形菌门、放线菌门和厚壁菌门等24个门的细菌，土壤菌群结构由于长期受石油污染的选择压力而发生了明显改变.尽管目前对于特定油田区土壤微生物群落特征研究已有一定研究基础，然而针对于具有地带性差异的不同油田区的土壤微生物群落的对比研究还存在不足，尚未清晰认知石油污染背景下的油田区土壤微生物群落地带性特征，及其与环境因子的互作关系.
辽河油田地处辽宁省盘锦市，属暖温带半湿润大陆性季风气候区，年平均气温约10℃，年降水量约650mm，大庆油田地处黑龙江省大庆市，属北温带半干旱大陆性季风气候区，年平均气温约5℃，年降水量约425mm，两油田所处地理环境的特征具有较显著的地带性差异.
对此，本研究通过采集辽河油田和大庆油田的石油污染土壤样品，借助高通量扩增子测序技术，展开以下研究：①了解不同石油污染环境下土壤微生物的群落结构特征;②预测土壤中具有石油降解功能的功能菌群;③揭示不同油田区土壤生境条件与石油污染土壤微生物群落特征的互作关系，为不同油田区石油污染土壤微生物群落的地带性分布研究从微生物地理学角度提供初步的理论基础和方法学探索.与此同时，油田区特异性的微生物群落构成特征也为进一步的功能微生物种质资源的开发与利用提供理论指导，以便准确高效的获取具有底物代谢特异性的石油多组分降解功能菌株，促进微生物修复技术的深入发展.
2材料与方法(Materialsandmethods)
2.1土壤样品采集
供试土样分别采自开采20年以上年限的辽河油田某油井(41°04′39″N，121°43′20″E)和大庆油田某油井(46°31′36″N，124°58′02″E)周边.样品于2019年10月采集完成，采集方法为以井口为中心，通过放射状布设采样点位，分别采集距井口0、10、20m处表层(10～20cm)土壤样品，样品编号：辽河油田样品记为L1⁃1、L1⁃2、L1⁃3、L2⁃1、L2⁃2、L2⁃3、L3⁃1、L3⁃2、L3⁃3，大庆油田样品记为D1⁃1、D1⁃2、D1⁃3、D2⁃1、D2⁃2、D2⁃3、D3⁃1、D3⁃2、D3⁃3，并将样品按照距井口距离进行分组，即划分为6个样品组：L1组(L1⁃1、L1⁃2、L1⁃3)、L2组(L2⁃1、L2⁃2、L2⁃3)、L3组(L3⁃1、L3⁃2、L3⁃3)、D1组(D1⁃1、D1⁃2、D1⁃3)、D2组(D2⁃1、D2⁃2、D2⁃3)和D3组(D3⁃1、D3⁃2、D3⁃3).采样日前10d内无降水，采样地无积水，地表为无植被覆盖的油田区典型原状土壤，采集的样品可以反映采样区土壤性质的常态.样品采集后分成两部分，一部分保存在4℃条件下，用于污油含量和土壤理化性质等指标测定，另一部分于-20℃条件下保存，用于土壤微生物群落分析。
2.2土壤污油含量及族组分测定
土壤中污油含量采用重量法测定(王如刚等，2010).准确称取4g过0.25mm孔径筛的土壤样品混入于15mL三氯甲烷中，振荡处理30min，静置8h，55℃水浴加热1h，再于4500r·min-1条件下离心5min，取上清液过滤至已称至恒重的干燥烧杯(m0)中，剩余土壤参照上述流程重复提取2次，收集合并提取液，风干后称重(m1)，土壤样品含油量(R)计算公式如下：R=(m1-m0)/4(1)石油族组分采用柱层析法测定(SY/T5119—1995).
以氧化铝(70～200目，400℃活化4h)和硅胶(80～100目，140℃活化8h)为吸附剂，分别以正己烷、二氯甲烷与正己烷的混合液(V二氯甲烷∶V正己烷=2∶1)、三氯甲烷为洗脱剂，依次分离原油中沥青质、饱和烃、芳烃和胶质，再采用重量法测定各组分含量.
2.3土壤理化性质测定
参照《土壤农业化学分析方法》(鲁如坤，1999)，土壤pH测定时以土水比1∶2.5(m∶V)混合振荡30min后用pH计测定;土壤含水率采用烘干法(105℃)测定;总有机碳(TOC)测定时，将过60目筛的土样经盐酸酸化去除无机碳后，再使用总有机碳/总氮分析仪(MultiN/C3100)测定;总氮(TN)采用凯式法测定;总磷(TP)采用碱熔⁃钼锑抗比色法测定.
2.4土壤微生物
DNA提取和高通量测序使用FastDNASpinKitforSoil试剂盒提取土壤微生物总DNA.对16SrRNA基因的V3～V4区进行PCR扩增，引物选择341F(5′⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCAG⁃3′)和806R(5′⁃GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3′).
PCR反应体系(25μL)为：土壤总DNA30ng、引物341F/806R(5μmol·L-1)各1μL、BSA(2ng·μL-1)3μL、2×TaqPlusMasterMix12.5μL、ddH2O调整PCR总体积至25μL.扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共计28个扩增循环，72℃最终延伸7min.PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.高通量测序委托北京奥维森基因科技有限公司通过IlluminaMiseq测序平台完成.测序结果已上传至SRA数据库(BioProjectID：PRJNA691428).
2.5数据处理和分析
在IlluminaMiseq测序平台得到的下机数据(RawPE)，用Trimmomatic0.36、Pear0.9.6和Flash1.20软件进行质量控制，过滤低质量的fastq数据并拼接后得到rawtags，再通过Vsearch2.7.1软件去除嵌合体，得到优质序列cleantags，采用Uparse方法进行OTU(Operationaltaxonomicunits)聚类分析，对比Silva16SrRNA数据库，采用RDPClassifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计各样品的群落组成.基于OTU聚类结果计算各项Alpha多样性指数。
3结果与分析(Resultsandanalysis)
3.1土壤石油污染特征分析
不同土壤样品组的石油含量和各组分占比情况.两个油田土壤样品组中L1和D1的石油含量最高，分别达到14.50g·kg-1和7.23g·kg-1，两个油田中土壤石油浓度L1>L2>L3、D1>D2>D3，说明辽河油田和大庆油田油井周边土壤中石油含量随着距井口距离的增加而减小.族组分分析表明，辽河油田污油组分中胶质所占比例最高，胶质和沥青质总量平均占比达54.36%±1.82%，高于大庆油田(42.99%±0.67%)，而烷烃所占比例仅为30.86%±4.52%，显著低于大庆油田(36.33%±3.34%)(p<0.01).
3.2土壤理化性质分析
不同土壤样品组的土壤理化性质.辽河油田和大庆油田土壤样品组中pH和含水量比较均呈L1L2>L3、D1>D2>D3，表明两个油田土壤的pH和含水率都随着距井口距离的增加而增大，TOC含量则随着距井口距离的增加而减小.两个油田土壤的TN和TP含量较高，且在距井口不同距离的位置没有明显差别(p>0.05).
辽河油田土壤中的N、P营养元素含量显著高于大庆油田(p<0.05).土壤样品的污油属性和理化性质指标的相关性分析结果，结果表明，土壤中石油含量与TOC含量呈显著正相关，与pH和含水量分别呈负相关;TN、TP含量与烷烃和芳烃组分占比分别呈负相关，而与胶质组分占比呈正相关.
4讨论(Discussion)
4.1油田土壤理化特性及石油污染特征
本研究发现，油田内土壤受石油污染程度随着距井口距离的增加而减小，张海玲等(2014)的研究结果表明油田土壤中石油含量随着距油井水平距离的增大而减少.土壤中含水率和pH随着石油含量的减小而增大，贾建丽等(2009)的研究结果表明，石油的强疏水性会导致具有高浓度石油含量土壤的疏水性较高，土壤储水能力减弱，含水率降低.刘五星等(2007a)对南京某油井周边土壤研究发现石油污染会引起土壤pH的下降，这与本研究的结果一致.
土壤中总有机碳含量在距离油井近处更高，这是因为由于采油活动产生的石油污染导致了土壤碳源的增加，而总氮和总磷的含量在同一油田内各位置的差异不大，这与刘五星等(2007b)和王传远等(2010)的研究结果相似.辽河油田污油与大庆油田污油的组分相比，辽河油田污油组分中胶质和沥青质的占比更高，这是因为辽河油田开采的原油主要是稠油，而大庆油田开采的原油主要是轻质油，并且辽河油田开采的主要是环烷基原油，而大庆油田为石蜡基原油，因此两油田土壤污油中烷烃组分占比都远高于芳烃.
微生物在利用石油烃类碳源(烷烃和芳烃)时会消耗土壤中的N、P，因此土壤中烷烃和芳烃含量占比与TN、TP含量呈负相关，而胶质由于生物可利用性较低，故呈现相反趋势.辽河油田土壤中的N、P含量高于大庆油田，这为土壤微生物的生长提供了更多的营养物质，与此同时，盘锦市属暖温带大陆性半湿润季风气候区，气候温度适宜，降水充沛，而大庆市地处北温带亚干旱季风气候区，冬季漫长，全年降水较少，故辽河油田地区生态环境为微生物提供了更优质的生存条件，使其微生物群落具有较强的抗胁迫能力.
4.2油田土壤微生物群落结构特征6个样品组的OTU数目统计及多样性指数分析结果表明，油田区土壤的微生物多样性随着距井口距离的减小而降低，究其原因主要为碳源及环境条件的不同，特定的微生物只能实现有限的石油烃类污染物的降解(马思佳等，2017)，井口处土壤微生物在高浓度石油污染胁迫作用下多样性降低.辽河油田和大庆油田的污油组成具有一定差异，其烃类含量及种类均很复杂，可诱导产生一定数目的稀有菌属，L1和D1土壤样品组中独有的OTU数量可以对此有所佐证.
5结论(Conclusions)
1)油井周边土壤微生物多样性具有明显的空间分布特征.距离井口越近，土壤中石油类污染物含量越高.烷烃、芳烃及胶质作为污染土壤中的主要碳源，是决定微生物群落差异性分布的核心因素.辽河油田和大庆油田由于石油组分差异较大，导致两个油田各自的微生物群落变异特征也有所不同，因此，土壤中石油的含量及其族组成是影响微生物群落结构变化的关键因子.
2)辽河和大庆两油田区污染土壤微生物群落存在异同特征.相同的是两个油田的优势菌门均包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)，相同优势菌属为Pseudarthrobacter属和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas).差异是辽河油田独特优势菌门为Saccharibacteria门，优势菌属为Defluviicoccus属、微枝形杆菌属(Microvirga)和分支杆菌属(Mycobacterium);大庆油田独特优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)，优势菌属为Salinimicrobium属、盐单胞菌属(Halomonas)、Idiomarina属、游动球菌属(Planomicrobium)、食烷菌属(Alcanivorax)和海杆菌属(Marinobacter).
3)污染物毒性是土壤中微生物结构变化的主要驱动因子，同时生态环境背景状况也是重要影响因素.辽河油田石油污染物中胶质含量高，毒性较大，但该地区生态环境较好，因此井口附近的微生物群落具有较强的抗胁迫能力，而大庆油田则表现出相反的现象，即脆弱生态环境下的微生物群落受污染物的影响更大.
4)微生物群落结构的变化反映了微生物的适应性.在石油污染的胁迫作用下诱导产生具有底物靶向性的石油降解功能菌群;发现7种菌属可能具有降解石油污染物的功能，可作为未来靶向性功能菌株筛选目标，其中2种为辽河油田区优势菌属：分支杆菌属(Mycobacterium)、Defluviicoccus属;5种为大庆油田区优势菌属：海杆菌属(Marinobacter)、盐单胞菌属(Halomonas)、Idiomarina属、Salinimicrobium属和食烷菌属(Alcanivorax).
参考文献(References)：
ArdakaniMR，PapizadehM.2019.BiodegradationofcrudeoilbyHalomonaselongatastrainKWPA⁃12：
AmoderatelyhalophilicstraindetectedinoilspillsaroundGarosulfidicsprings，MISOilfield，Iran[J].Energy，EcologyandEnvironment，4(1)：26⁃36
BoukirA，AriesE，GuilianoM，etal.2001.Subfractionation，characterizationandphotooxidationofcrudeoilresins[J].Chemosphere，43(3)：279⁃286
作者：荆佳维1，2，3，王卅1，3，郭书海1，3，∗
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