本文摘要：摘 要：为了明确十字花科与茄果类蔬菜作物根肿菌侵染根细胞的变化特征，本试验选取十字花科蔬菜青花菜品种中青 10号和中青 16 号(感病组)，番茄品种中杂 302 和辣椒品种中椒 115(对照组)进行比较试验，通过对两组试验对象进行根部染色及细胞学观察，揭示青花菜、番茄和
摘 要：为了明确十字花科与茄果类蔬菜作物根肿菌侵染根细胞的变化特征，本试验选取十字花科蔬菜青花菜品种中青 10号和中青 16 号(感病组)，番茄品种中杂 302 和辣椒品种中椒 115(对照组)进行比较试验，通过对两组试验对象进行根部染色及细胞学观察，揭示青花菜、番茄和辣椒在根肿菌侵染过程中的根部特征和差异变化。分子辅助鉴定结果表明，供试菌株(河南新野)为 4 号生理小种。以水培法培育青花菜、番茄和辣椒幼苗，在根肿菌接种后 14 d 内，根肿菌侵染途径基本一致：根肿菌最先进入 3 种蔬菜作物的根毛区，然后继续侵入根部皮层细胞，形成分生孢子或孢子囊。在根肿菌侵染率方面，青花菜与番茄、辣椒存在明显差异：根肿菌在接种后 7 d 和 14 d 能够快速侵染青花菜，并在 14 d 时的皮层细胞内形成大量的分生孢子和孢子囊;根肿菌侵染番茄的速率明显低于青花菜，且根肿菌侵染数量明显减少，仅在根毛区形成分生孢子，能侵染皮层细胞但不能形成孢子囊;辣椒根毛区根肿菌侵染速率最慢，且根肿菌侵染效率最低，只在根毛区形成少量的分生孢子，极少数孢子能进入皮层细胞，但不能形成孢子囊。本试验揭示了我国主要根肿病致病菌(4 号生理小种)在水培环境下侵染青花菜、番茄和辣椒的变化特征，为科学解释茄果类蔬菜抗根肿病机理提供了依据，也为创制十字花科抗根肿病种质开辟了一条新途径。
关键词：青花菜;番茄;辣椒;水培法;根肿菌;分子鉴定;侵染过程
根肿病是一种土传病害，对世界范围内的十字花科作物危害严重，该病可由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染植株根系引发，根肿菌在土壤中可存活数年，传播方式呈现多样化。近些年，我国青花菜(Brassica oleracea L. var.italic)栽培面积逐年增加(李占省 等，2021)，根肿病也开始在部分地区发生且呈扩大趋势，目前已在浙江、云南、湖北、河南、重庆等地发生。
根肿病会造成青花菜商品性降低，甚至难以形成正常花球，影响产量和质量，严重时造成绝收。十字花科根肿病的防治方法有物理防治(撒石灰、石灰氮等)和化学防治(氟啶胺)等，但最根本的方法是选育抗性品种(Webster & Dixon，1991;Wallenhammar et al.，2008)。
目前，根肿菌在土壤中侵染十字花科作物的生活史已很清楚(杨晓琴，2015)。十字花科根肿病鉴定方法主要分为两类，一是建立在病圃基础上的鉴定技术，二是离体接种鉴定。两种方法鉴定周期均较长，管理风险大，耗费大量的人力与物力，故探索和建立十字花科根肿病快速鉴定方法将极大地提高鉴定效率(Deora et al.，2012)。
根肿菌生理小种的鉴定方法主要有两种：Williams 鉴定系统和欧洲根肿病 ECD 鉴定系统(Williams，1966;Buczackl et al.，1975)。Williams 鉴定系统具有寄主少、简单易操作等优点，在国际上被广泛使用。然而，Williams 鉴定系统只能鉴别出 13 个生理小种，且当多个生理小种混杂时，采用 Williams 鉴定系统并不能够准确地将优势小种鉴别出来，所以该方法存在一定的局限性(Feng et al.，2016;白宇鹏，2019)。
ECD 鉴定系统具有较好的实用性，准确度较高，且能够更加细致地划分生理小种，但 ECD 鉴定系统寄主较多，存在难收集、工作量较大和操作程序较为复杂的问题(丁云花 等，2013;朱翠娟，2016)。原玉香等(2017)研究发现，在对同一地区的 2 份菌株进行鉴定时，采用 Williams 鉴定系统和 ECD 鉴定系统鉴定的结果不一致，表明两种鉴定系统对同一地区生理小种的鉴定结果存在差异。
近些年，水培接种法作为一种快速鉴定根肿病抗性的技术逐渐显现其优越性，具有操作简单、方便快捷等优点，通过离体接种和染色观察(杜艳 等，2016)，可以从细胞学水平上快速鉴定十字花科作物根肿病抗性，应用前景广阔。相比十字花科作物，根肿病不会对茄果类作物造成危害，探寻及利用该抗性机理选育抗根肿病的十字花科作物新品种具有极其重要的意义和科学价值。因此，揭示并阐明十字花科和茄果类作物在根肿菌侵染过程及其防御能力上的差异，将为创制十字花科抗根肿病种质资源提供新思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于 2019 年 7—9 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行，种子均为商品种，青花菜品种为中青 10 号和中青 16 号，番茄(Solanumlycopersicum)品种为中杂 302，辣椒(Capsicumannuum L.)品种为中椒 115，均由本所自主育成。
1.2 试验方法
1.2.1 种子预处理
2019 年 7 月将青花菜、番茄和辣椒种子撒播在浸湿的滤纸上，将滤纸放入培养皿中催芽，6 d 后将幼苗移到 15 mL 的离心管中，每管加入 14 mL 蒸馏水，只放入 1 株幼苗用泡沫筛固定，离心管用锡箔纸包裹进行遮光处理，根肿菌侵染过程在水培溶液中进行。
1.2.2 根肿菌分子辅助鉴定
供试根肿菌菌株来自河南新野青花菜、大白菜肿块，由河南省农业科学院园艺研究所魏小春老师提供并已鉴定为生理小种4 号，将根肿病肿块洗净风干后超低温(-80 ℃)保存备用。采用 CTAB 法提取肿块 DNA(李占省，2012)。
根据已报道的根肿菌生理小种特异引物进行 PCR 扩增和鉴定(Zheng et al.，2018)。PCR 反应体系：5.0 μL 的 2× Taq Plus Master Mix，2.0 μL 的 ddH2O，2.0 μL DNA，正反引物各 0.5μL，总体积 10.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性 5min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环;72 ℃后延伸 5 min，10 ℃保存。采用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，每孔点入 5 μL PCR 产物，在 150 V 恒压下电泳 25 min，后置于自动凝胶成像系统中成像观察。
1.2.3 根肿菌菌液制备
将 -80 ℃冰箱中的根肿病肿块在室温下解冻，称取 10.0 g，用刀片将根肿病肿块切成小片后放入研磨机，加入 1.0 L 蒸馏水机械研碎成浆液，时间为 3 min。将磨好的浆液用8 层尼龙网布过滤，以 500 r · min-1 的转速离心 5min，取上清液，最后，用血球计数板和光学显微镜将孢子浓度稀释至 4 × 107 个 · mL-1，4 ℃保存备用。
1.2.4 根肿菌侵染
移至离心管的中青 16 号、中青 10 号、中椒 115 和中杂 302 幼苗水培 3 d 后，在离心管中加入 2 mL 孢子浓度为 4 × 107 个 · mL-1 的根肿菌菌液，侵染处理过程参考张小丽(2014)的方法并进行调整。将接种后的水培苗放入人工气候培养箱中培养。培养条件：16 h 光照，25 ℃ ;8 h黑暗，20 ℃ ;相对湿度 75%。
1.2.5 镜检观察
在接种后 7、12、14 d，利用显微镜对供试对象根细胞进行观察，确定初级、次级侵染时期根肿菌侵染过程。首先，用蒸馏水清洗试验材料根上的附着孢子，然后将根切成 1～2 cm 长的小段，用 FAA 固定 24 h，同时用荧光桃红染液染色 15 min，染好的根部组织置于载玻片上用清水冲洗掉多余染液，最后进行镜检观察，分别统计侵染和未侵染的根毛数，计算根毛侵染率。每时间点选取 3 个单株分别观察和拍照。根毛侵染率=(被侵染的根毛数 / 观察的总根毛数)× 100%
2 结果与分析
2.1 生理小种的分子辅助鉴定
根据已报道的根肿菌生理小种特异引物对河南新野菌株进行 PCR 扩增，结果表明，6 对特异引物 Novel342-2、Novel407-2、PBRA_007750-2、PBRA_008439-1、PBRA_009348-1 和 Actin1 均能扩增出目标条带。
通过 Novel342-2、PBRA_009348-1 和 Novel407-2 PCR 扩增结果可以确定 4 号、7 号和 9 号生理小种的存在情况，若特异引物 Novel342-2 能扩增出特异产物，则可以鉴定存在根肿菌 4 号生理小种;若特异引物 Novel342-2 或 Novel407-2 不能扩增出特异产物，则可以鉴定存在根肿菌 7 号生理小种;若特异引物 PBRA_009348-1 能扩增出特异产物，且 Novel342-2 或 Novel407-2 不能扩增出目标产物，则可以鉴定存在根肿菌 9 号生理小种。本试验 中， 特 异 引 物 Novel342-2、PBRA_009348-1和 Novel407-2 均能扩增出特异片段，故可以确定该菌株存在 4 号生理小种。
不存在 7 号和 9号 生 理 小 种。 通 过 特 异 引 物 PBRA_007750-2、PBRA_009348-1 和 PBRA_008439-1 的 PCR 扩增结果可以判断 11 号生理小种的存在情况，若特异引物 PBRA_009348-1 未扩增出特异产物而PBRA_007750-2 或 PBRA_008439-1 可以扩增出特异产物，则可以推断存在根肿菌 11 号生理小种，但本试验中，特异引物 PBRA_009348-1 能扩增出特异产物，可推断该供试菌株中不存在 11 号生理小种。综上所述，推断该根肿菌只存在 4 号生理小种，这与河南省农业科学院园艺研究所原图 3 根肿菌生理小种 PCR 扩增产物 玉香等(2017)的报道结果一致。
2.2 青花菜、番茄和辣椒根肿菌侵染过程观察
比较水培青花菜根肿菌侵染过程显示，青花菜根部用荧光桃红染液染色后，被根肿菌侵染的根毛呈红色，未被侵染的根毛为无色。在接种后 7 d，青花菜根毛细胞内有大量分生孢子侵入，表明根肿菌已侵染根毛，此时中青 16 号的根毛侵染率为 46.62%。在青花菜根肿菌侵染过程中，中青 16 号比中青 10 号生长势强，接种后，中青 16 号能维持较长一段时间的正常生长，而中青 10 号在接种后死亡速度较快，故未能进行观察。
根部皮层细胞内有大量的孢子囊形成。随着侵染时间的延长，接种后 12 d 比 7d 时的根毛侵染率明显提高 25.38%。到接种后 14d 时，根毛侵染率上升减缓，比接种后 12 d 时提高了 11.40%，根毛侵染率达到 83.40%。由此可见，在接种后 7～14 d 根肿菌能够快速侵染青花菜，且在不同基因型间存在侵染速率上的差异。本试验中，中青 16 号相比中青 10 号在接种后能够延长生存时间，滞缓根肿菌侵染速率，但在接种后 14d 时，中青 16 号根部皮层细胞内仍形成大量的孢子囊。
番茄品种中杂 302 水培接种根肿菌侵染过程显示，在接种后 7 d 时根肿菌开始侵染根毛，此时根毛侵染率较高，为 32.80%，但比青花菜中青 16 号的根毛侵染率低。接种后 12 d 时仍有部分番茄根毛被根肿菌侵染，相比接种后 7 d 的根毛侵染率提高不到 10%，部分根肿菌孢子已进入根部皮层细胞，但明显低于中青 16 号的侵染率。接种后 14 d 时番茄根毛发生明显扭曲，根部皮层细胞可明显观察到侵入的根肿菌分生孢子，此时根毛侵染率为 48.21%。
3 结论与讨论
近年来，十字花科作物受根肿病影响和危害越来越大，备受国内外关注。青花菜在国内外广泛种植，2019年我国种植面积约8.67万hm(李占省 2 等，2019)。目前，根肿病已严重危害青花菜主产区的栽培，如浙江台州、云南通海、河南新野等地，危害面积逐年增加。为了更好地挖掘和创制青花菜抗根肿病资源，本试验以抗根肿病的茄果类蔬菜作物番茄和辣椒为对照，以感病青花菜作为目标研究对象，通过水培法观察根肿菌侵染茄果类和十字花科类作物根部细胞的过程，来揭示对照组和感病组在根肿菌侵染过程中的差异变化，为十字花科选育抗根肿病资源提供一种新思路。
本试验为了准确鉴定根肿菌生理小种的种类，结合国内外报道，特选用根肿菌生理小种特异分子标记进行鉴定，与原玉香等(2017)报道的河南新野菌株为 4 号生理小种的研究结果一致，表明分子鉴定可作为一种辅助手段实现根肿菌生理小种的快速鉴定。
不同青花菜基因型间以及不同科属作物间根肿菌的侵染过程均存在显著差异，但相同的是番茄、辣椒与青花菜一样，在水培条件下都能够被根肿菌侵染，且其侵染过程与十字花科作物青花菜相似，都是从进入根毛开始，再侵染根部皮层细胞，形成分生孢子或孢子囊，但在根肿菌侵染率方面，三者存在明显差异：青花菜上根肿菌的根毛侵染率明显高于番茄和辣椒。
从观察结果来看，虽然后期中青16 号、中杂 302 和中椒 115 的根毛侵染率均有所增加，但番茄和辣椒明显低于青花菜，与接种后 12 d相比，接种后14 d时番茄根毛侵染率提高了6.41%，辣椒根毛侵染率提高了 1.80%，而青花菜根毛侵染率提高了 11.40%;从进入根毛的根肿菌孢子数量来看，中青 16 号也明显多于中杂 302 和中椒 115。综上所述，青花菜与番茄、辣椒在根肿菌侵染率方面存在明显差异，青花菜根肿菌侵染速率和侵染率最高，其次是番茄，辣椒最低，且番茄、辣椒根部皮层细胞不能形成孢子囊。
本试验中，番茄和辣椒根际分泌物可能发挥了根肿菌防御作用，但在水中根际分泌物可能有别于土壤(Gossen et al.，2019)，水中番茄和辣椒的根际分泌物会被稀释，因此根肿菌能够侵染根毛和皮层。土壤栽培环境下根肿病并不会对番茄和辣椒造成危害，从而验证了茄果类蔬菜根际分泌物的重要性，暗示了可以通过在土壤中增施茄果类蔬菜根际分泌物的方式来预防和降低十字花科蔬菜根肿病的危害，这将是一种更加绿色、环保和高效的方法(张婷玉 等，2014;韩旭 等，2015;杨丹丹 等，2018;Fu et al.，2019)。
此外，高附加值的十字花科作物或许可以通过嫁接茄果类作物优良砧木来预防根肿病的发生。本试验结果为以上两种方法提供了一定的科学依据和技术支撑，为选育十字花科高抗和免疫根肿病材料提供了新思路。目前，国内外报道的十字花科蔬菜抗根肿病基因主要来自芜菁、萝卜和大白菜(Suwabe et al.，2003，2006;Zhanget al.，2015)，其中芜菁报道最多，发现了 11 个主效基因或 QTL(Piao et al.，2004)，茄果类蔬菜尚未见抗根肿病基因的相关报道，其免疫机理有待深入研究与利用。
参考文献
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杜艳，刘邮洲，刘永锋，李建斌，乔俊卿，许凌宇.2016.甘蓝根肿病菌休眠孢子的生物学特性及侵染寄主的显微观察.西南农业学报，29(6)：1323-1327.
韩旭，牛玉，杜公福，曹振木.2015.水培黄灯笼辣椒根系分泌物的化学成分鉴定.贵州农业科学，43(12)：151-156，160.
李占省.2012.青花菜中莱菔硫烷含量遗传分析、QTL 定位及相关基因研究〔博士论文〕.北京：中国农业科学院.
李占省，刘玉梅，方智远，杨丽梅，庄木，张扬勇，吕红豪，王勇.2019.我国青花菜产业发展现状、存在问题与应对策略.中国蔬菜，(4)：7-11.
李占省，刘玉梅，韩风庆，方智远，杨丽梅，庄木，吕红豪，王勇，季家磊.2021.“十三五”我国青花菜遗传育种研究进展.中国蔬菜，(1)：33-40.
杨丹丹，胡承孝，程勤，贾玮，赵小虎.2018.根肿菌与根系互作效应及其影响因素研究进展.中国农学通报，35(34)：77-81.
作者：谢 琪 刘玉梅 韩风庆 庄 木 李占省
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