谷子 SiPSY1 基因与米色形成相关性分析

所属分类：电子论文阅读次时间：2021-11-12 16:42

本文摘要：摘要：为明确谷子八氢番茄红素合成酶基因与谷子米色形成的相关性，本研究从黄色和白色 2 种不同米色谷子中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全长序列，并进行生物信息学分析，同时，利用实时荧光定量 PCR 方法检测该基因在谷子米色形成过程中的表达模式。结果表明，SiPSY1

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　　摘要：为明确谷子八氢番茄红素合成酶基因与谷子米色形成的相关性，本研究从黄色和白色 2 种不同米色谷子中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全长序列，并进行生物信息学分析，同时，利用实时荧光定量 PCR 方法检测该基因在谷子米色形成过程中的表达模式。结果表明，SiPSY1 基因编码序列(CDS)全长为 1 248 bp，共编码 415 个氨基酸。 SiPSY1 蛋白的理论分子量为 46􀆰 866 kDa，等电点为 8􀆰 97，为不稳定亲水性蛋白。该蛋白的二级结构由 α 螺旋(57􀆰 35%) 、不规则卷曲(29􀆰 64%) 、延伸链结构(9􀆰 88%)和 β 转角(3􀆰 13%)四种结构组成。 SiPSY1 蛋白与玉米 ZmPSY1 的同源性较高，二者的亲缘关系较近。在谷子米色形成的初期和中期，黄色米色品种籽粒中 SiPSY1 基因的表达水平显著高于白色米色品种，而在米色形成后期，该基因在白色米色品种中的表达水平显著提高，并高于在黄色米色品种中的表达水平。随着籽粒成熟米色的形成，SiPSY1 基因在黄色米色品种七月黄中的表达量呈先上升后显著下降的趋势，在白色米色品种中呈逐渐上升的趋势。通过对 SiPSY1 基因结构和表达特性的分析，初步推测谷子米色差异及形成与 SiPSY1 基因结构无关，而与基因的表达特性有一定的相关性。本研究结果为进一步阐明 SiPSY1 基因的功能以及谷子米色形成的分子机制奠定了基础。

　　关键词：谷子; 米色; SiPSY1 基因; 基因克隆; 表达模式

分子材料论文

　　类胡萝卜素是一种天然色素，常积累于高等植物花、果实的成色母细胞中，使其表现出黄色、红色或橙色。此外，类胡萝卜素也是某些植物根和种子中的重要色素[1] 。

　　类胡萝卜素在植物光合作用及光保护作用中具有重要作用[2-3] ，在增强人体免疫、延缓衰老、预防心血管慢性疾病以及防癌抗癌方面也具有重要功效[3-5] 。类胡萝卜素作为重要的功能性成分受到广泛关注。目前，类胡萝卜素生物合成途径已基本明确，是类异戊二烯代谢体系中的一个分支，过程包括缩合、脱氢、环化、羟基化以及环氧化反应[6] 。

　　在类胡萝卜素生物合成途径中，多种酶发挥关键作用，其中，八氢番茄红素合成酶( phytoene synthase， PSY)是第一个限速酶，可催化两分子牻牛儿基牻牛儿基二磷酸 (geranylgeranyl diphosphate， GGPP ) 产生第一个类胡萝卜素分子———八氢番茄红素[6-8] 。研究者已利用cDNA 3′ 末端快速扩增技术 ( rapid amplification of cDNA 3′ ends， 3′ RACE ) 、逆转录 - 聚合酶链反应 ( reverse transcription⁃polymerase chain reaction， RT⁃ PCR) 等技术在玉米[9] 、拟南芥[10-11] 、番茄[12] 、油菜[13] 、小麦[14] 、枸杞[15] 、甘薯[16] 、鸡爪槭[17] 等植物中分离克隆了 PSY 基因，对基因的序列特征开展了一系列生物信息学分析[18-19] ，并通过超表达载体的构建对该基因在多种植物中的功能进行了研究，获得了一些具有特殊颜色的转基因植物，如胚呈橙黄色的转基因油菜[20] 、胚乳呈金黄色的“金大米” [21]等。

　　谷子[ Setaria italica( L.) Beauv] 是我国北方重要的杂粮作物，去壳后的小米具有较高的营养价值，深受消费者的青睐，而米色是评价小米品质的重要指标。小米中富含类胡萝卜素，平均含量为 1􀆰 2 mg·kg-1 ，是玉米的 2 倍[22] 。从不同米色品种的小米中提取黄色素，并进行成分分析，发现米色与类胡萝卜素的成分及含量具有一定的相关性[23-24] ，但目前关于米色形成的分子机制仍不明确，且对控制谷子类胡萝卜素生物合成关键酶基因及其功能的研究较少。

　　基于此，本研究以不同米色谷子为试验材料，分离克隆了 SiPSY1 的 cDNA 全长，通过对基因结构以及该基因在谷子米色形成过程中表达特性差异的分析，初探 SiPSY1 基因与谷子米色形成的相关性，以期为进一步开展谷子类胡萝卜素调控机制的研究以及明确谷子米色形成分子机制提供理论依据。

　　1　材料与方法

　　1􀆰 1　材料种植及取材

　　选择黄色(七月黄、三变黄)和白色(白谷白米谷、白米糙)2 种不同米色品种的谷子为试验材料，材料均为山西农业大学玉米研究所谷子课题组收集的农家种，种植于山西农业大学玉米研究所试验田，试验田肥力均匀，地势平坦。采用随机区组试验设计，设置 3 次重复。行长 3 m，行距 40 cm，三行区。取材时，各品种每个重复选择中间行 3 株生长一致健康植株的籽粒进行混合，用镊子快速准确地剥下相同灌浆状态下的籽粒，在液氮中速冻后于-80℃低温保存。 3 个取样时期分别为：S1(米色形成初期，胚乳呈粉状) ，S2(米色形成中期，胚乳质地硬化) ，S3(米色形成后期，籽粒成熟) 。

　　1􀆰 2　总 RNA 提取和 cDNA 合成将低温保存的籽粒取出，去壳后置于液氮中研磨成粉末，参照 EZ-10 Total RNA Mini⁃Preps Kit RNA 提取试剂盒(上海生工生物) 说明书提取籽粒总 RNA， RNA 浓度及质量分别通过 Nanodrop 2000c 超微量核酸蛋白测定仪(美国赛默飞)和 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 cDNA 合成按照 M⁃MuLV 第一链 cDNA 合成试剂盒(上海生工生物) 说明书的步骤进行，获得的 cDNA 利用内参引物进行 PCR 扩增验证。

　　1􀆰 3　引物设计参考玉米 ZmPSY1 基因序列，在谷子基因组数据库中查找同源性最高的基因序列，分别以 cDNA 和 CDS 序列为模板，利用 Primer 5 软件设计克隆引物和定量引物，其中 SiActin 是内参基因。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

　　1􀆰 4　 PCR 扩增及测序以上述获得的谷子籽粒 cDNA 为模板，PCR 扩增 SiPSY1 基因 cDNA 全长。采用 50 μL 反应体系，PCR 程序为：95℃预变性 2􀆰 5 min;95℃变性 15 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个循环;72℃ 延伸 10 min 后 4℃保存。利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测并分离 PCR 产物，使用胶回收试剂盒对目标片段进行回收后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

　　1􀆰 5　生物信息学分析利用 DNAMAN 软件进行序列开放阅读框的翻译、同源性比对以及系统进化树的构建，通过 ProtParam 网站进行蛋白质理化特性分析，分别采用 SOPMA 和SWISS⁃MODEL 在线网站预测蛋白质二级结构和三级结构，应用 MultAlin 网站进行多序列比对。

　　1􀆰 6 　实时荧光定量 PCR ( quantitative real⁃time PCR， qRT⁃PCR) 使用 SGExcel FastSYBR qPCR 预混液(含 ROX) 试剂盒进行 qRT⁃PCR，采用 50 μL 反应体系：25 μL 2× SGExcel FastSYBR Mixture(含 ROX) ， 2 μL cDNA，上、下游引物(10 μmol·L-1 )各 1 μL，最后加入 RNase⁃Free ddH2O 至 50 μL。

　　使用 CFX96 TouchTM荧光定量 PCR 检测系统 ( 美国伯乐) ，反应程序为： 95℃ 预变性 3 min;95℃变性 5 s，60℃ 退火 20 s，40 个循环。每个反应设置 3 次技术重复。采用 2 -ΔΔCT 法，通过 Bio⁃RadCFX Manager 3􀆰 1 软件计算基因相对表达量。利用 SPSS 17􀆰 0 软件进行统计学分析。

　　2　结果与分析

　　2􀆰 1　 SiPSY1 基因的克隆与序列差异分析

　　以黄色和白色 2 种不同米色谷子为材料，提取籽粒总 RNA，进一步反转录成 cDNA，以 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增获得了约 1 500 bp 的目标片段。将产物送至公司进行测序，对不同品种 SiPSY1 基因的编码序列(coding sequence， CDS)进行比对，发现该基因序列在不同品种间无差异，说明其在不同品种中编码相同的氨基酸。利用 DNAMAN 软件对基因序列进行翻译，结果表明 SiPSY1 基因 CDS 全长为 1 248 bp，共编码 415 个氨基酸。

　　2􀆰 2　 SiPSY1 基因生物信息学分析

　　2􀆰 2􀆰 1　蛋白质理化性质分析利用 ProtParam 在线分析 SiPSY1 的氨基酸序列，结果表明其理论分子量为 46􀆰 866 kDa，等电点为 8􀆰 97，分子式为 C2072 H3308 N592 O605 S21 ，构成该蛋白的氨基酸中，亮氨酸含量最高，占 11􀆰 6%，其次为丙氨酸和精氨酸，均占 9􀆰 9%，组氨酸含量最低，仅为 0􀆰 5%。不稳定系数为 62􀆰 61，属于不稳定蛋白。其亲水性平均系数 ( grand average of hydropathicity，GRAVY)为-0􀆰 284，属于亲水性蛋白。

　　2􀆰 2􀆰 2　蛋白质结构预测利用 SOPMA 网站在线预测 SiPSY1 蛋白质的二级结构，结果表明，该蛋白质由 α 螺旋(238 个氨基酸残基，占 57􀆰 35%) 、不规则卷曲(123 个氨基酸残基，占 29􀆰 64%) 、延伸链结构 (41 个氨基酸残基，占 9􀆰 88%)和 β 转角(13 个氨基酸残基，占 3􀆰 13%)构成。通过 SWISS⁃MODEL 网站获得了 SiPSY1 蛋白质的三级结构模型，与二级结构预测结果基本一致。

　　2􀆰 2􀆰 3　同源序列与系统进化分析利用 DNAMAN 软件对克隆获得的谷子 SiPSY1 氨基酸序列与 NCBI GeneBank 中其他植物的 PSY1 氨基酸序列进行比对，分析了它们的同源性和进化关系。

　　谷子 SiPSY1 编码氨基酸与多种植物 PSY1 编码氨基酸具有同源性，有多个保守区域，其中，与玉米 ZmPSY1 的同源性最高，达到 84􀆰 77%，其次为水稻 OsPSY1，同源性为 77􀆰 5%，与小麦 TaPSY1 的同源性为 73􀆰 86%，此外，与拟南芥 AtPSY1、辣椒 CaPSY1 的同源性相同，均为 62􀆰 95%，与番茄 SlPSY1、木薯 MePSY1 和油菜 BnPSY1 的同源性相同，为 62􀆰 73%。基于以上多重序列比对结果，进一步构建了系统进化树，结果表明，谷子 SiPSY1 与玉米 ZmPSY1 的亲缘关系最近，与另外 2 个禾本科作物水稻和小麦的 PSY1 亲缘关系次之，而与其他植物的 PSY1 亲缘关系较远。

　　2􀆰 3　 SiPSY1 基因在不同谷子品种米色形成过程中的表达特性分析通过 qRT⁃PCR 的方法，测定分析了 SiPSY1 基因在不同米色谷子品种中的表达差异以及在谷子米色形成过程中表达水平的变化情况，。

　　SiPSY1 基因在谷子籽粒中的相对表达量存在品种差异，具体表现为，在米色形成初期( S1)和中期( S2) ，SiPSY1 基因在 2 个黄色米色品种中的表达水平均显著高于在白色米色品种中的表达水平。在米色形成后期( S3) ， SiPSY1 基因在 2 个白色米色品种中的表达水平，高于在黄色米色品种中的表达水平。在谷子米色形成过程中，SiPSY1 基因在黄色米色品种七月黄中的相对表达量表现为先上升后显著下降的趋势，在三变黄中呈下降趋势，但 3 个时期的变化并不显著。而在 2 个白色米色品种中，SiPSY1 的相对表达量均表现为逐渐上升的趋势，其中，在白谷白米谷米色形成后期( S3) ，表达量显著升高，在白米糙米色形成各时期的变化均达到显著水平。

　　3　讨论

　　在植物类胡萝卜素生物合成途径中，两分子 GGPP 在八氢番茄红素合成酶( PSY)作用下生成第一个类胡萝卜素分子———八氢番茄红素。 PSY 作为第一个限速酶，其编码基因成为研究类胡萝卜素生物合成机制以及利用基因工程技术提高植物类胡萝卜素含量的首选目的基因[25] 。

　　目前，在多种植物中已经成功克隆分离出 PSY 基因，并鉴定出 PSY 基因家族中的 3 个成员，分别为 PSY1、PSY2 和 PSY3，3 个基因具有器官或质体表达特异性。其中，PSY1 主要在含有有色体的花、果实和种子中调控类胡萝卜素的合成[25-28] 。本研究以不同米色谷子品种籽粒为研究材料，利用同源克隆技术，获得了谷子 SiPSY1 基因的 cDNA 全长，其开放阅读框( open reading frame， ORF) 包含 1 248 个碱基，共编码 415 个氨基酸。谷子 SiPSY1 蛋白与同属于 C4 禾本科作物玉米的 ZmPSY1 同源性最高，为 84􀆰 77%，二者亲缘关系最近。

　　4　结论

　　本研究从黄色和白色两种不同米色谷子籽粒中克隆出 SiPSY1 基因的 cDNA 全长序列，该基因的 CDS 全长为 1 248 bp，共编码 415 个氨基酸。通过 qRT⁃PCR 分析表明，在谷子米色形成初期和中期，SiPSY1 基因在黄色米色品种籽粒中的表达水平显著高于白色米色品种，由此推测谷子 SiPSY1 基因的表达特性与谷子米色形成具有一定的相关性。

　　参考文献：

　　[ 1 ]　朱长甫，陈星，王英典. 植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[ J]. 植物生理与分子生物学学报， 2004， 30(6) ： 609-618

　　[ 2 ]　朱运钦，乔改梅，王志强. 植物类胡萝卜素代谢调控的研究进展 [ J]. 分子植物育种， 2016， 14(2) ： 471-474

　　[ 3 ]　吴园园，于玉凤，王怡惠. 植物类胡萝卜素合成代谢调控机制研究进展[ J]. 植物学研究， 2020， 9(3) ： 217-225

　　[ 4 ]　 Fassett R G， Coombes J S. Astaxanthin in cardiovascular health and disease[ J]. Molecules， 2012， 17(2) ： 2030-2048

　　[ 5 ]　 Mordente A， Guantario B， Meucci E， Silvestrini A， Lombardi E， Martorana G E， Giardina B， Böhm Ⅴ. Lycopene and cardiovascular diseases： An update [ J]. Current Medicinal Chemistry， 2011， 18 (8) ： 1146-1163

　　[ 6 ]　霍培，季静，王罡，关春峰. 植物类胡萝卜素生物合成及功能 [ J]. 中国生物工程杂志， 2011， 31(11) ： 107-113

　　作者：禾璐1，2 贾苏卿1 赵芳玉1 刘晶2 张彬2 侯思宇2 韩渊怀2，∗