本文摘要：摘要通过生物信息学技术分析比较认知完好的老年人(60~99岁)与中青年人(20~59岁)脑部海马组织(hippocampaltissue，HC)的基因芯片数据，初步筛选出差异表达基因，进而预测治疗脑老化的潜在中药药物。从基因表达数据库(GeneExpressionOmnibus，GEO)下载GSE11882
摘要通过生物信息学技术分析比较认知完好的老年人(60~99岁)与中青年人(20~59岁)脑部海马组织(hippocampaltissue，HC)的基因芯片数据，初步筛选出差异表达基因，进而预测治疗脑老化的潜在中药药物。从基因表达数据库(GeneExpressionOmnibus，GEO)下载GSE11882基因芯片，基于R语言软件筛选差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)，通过STRING数据库、Cytoscape软件及其插件分析得到差异表达基因的关键基因，对关键基因进行基因本体论(geneontology，GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，通过关键基因与医学本体信息检索平台(CoremineMedical)相互映射，筛选治疗脑老化的中药，并构建“药物活性成分作用靶点”网络。筛选出268个差异表达基因，包括246个下调基因和22个上调基因。差异表达基因共得出15个关键基因，关键基因主要参与白细胞迁移、中性粒细胞活化、细胞趋化运动、小胶质细胞活化、免疫效应过程的调节等生物过程。KEGG通路分析显示关键基因主要富集于炎症过程、免疫反应、细胞因子细胞因子受体相互作用、PI3KAkt信号通路、Rap1信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、产生IgA的肠道免疫网络通路等。筛选得到治疗脑老化的潜在中药为三七、人参、丹参、黄芪等。差异表达基因和关键基因的分析促进了对脑老化机制的理解，该研究为脑老化中药干预的新药开发提供了潜在基因靶标与研发思路。
关键词脑老化;生物信息学;差异表达基因;中药预测
衰老是随着年龄增加而缓慢出现、普遍发生的生物学过程[1]，大脑在衰老过程中主要表现为学习和记忆、注意力、决策速度、感官感知和运动协调能力的下降[2]。脑老化是大多数神经退行性疾病的主要危险因素，包括阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease)和帕金森病(Parkinson'sdisease)，其患病率随着年龄的增长而不断增加，与衰老相关的神经退行性疾病很少或没有有效的治疗方法，这些疾病往往以不可逆转的方式进展，已成为日益严重的全球公共卫生问题，给家庭和社会带来了巨大的负担[3]。
脑老化过程涉及多个复杂的分子途径，机制尚未阐明，单个通路不足以解释脑老化的发生、发展过程，而中医药多成分、多靶点、多途径的特征，有利于缓解脑老化进程进而起到治疗作用。因此，识别脑老化中特定、敏感和可靠的生物标志物和病理基因，挖掘潜在中药治疗，有利于衰老相关的神经退行性疾病的早期诊断与治疗。故本研究基于基因表达数据库(GeneExpressionOmnibusdatabase，GEO)数据库中原始芯片数据，通过生物信息学的分析方法，初步筛选差异表达基因，进一步发掘关键基因，对关键基因的功能和通路进行富集分析，并将关键基因与中药相互映射，得到潜在的治疗靶点及药物，为脑老化分子机制和治疗药物的新发现提供实验研究的思路和理论依据。
1资料与方法
1.1数据提取从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载编号为GSE11882的基因片段原始数据。该数据集包括24位认知完好的老年人(6099岁)与18位中青年(2059岁)死后脑部海马组织(hippocampaltissue，HC)的基因芯片数据。该片段平台为GPL570[HGU133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array。
1.2数据预处理
基于语言Bioconductor库(http://www.bioconductor.org/)相关包对表达谱芯片进行数据预处理，通过“GEOquery”包[4]从GEO数据库中下载GSE11882，去除掉个探针对应多个分子的探针，当遇到对应同一个分子的探针时，仅保留信号值最大的探针，过滤后的数据通过箱式图查看样本标准化的情况，通过主成分分析(principalcomponentsanalysis，PCA)图以及统一流形逼近与投影(uniformmanifoldapproximationandprojection，UMAP)图查看样本分组间聚类情况。
1.3差异基因
差异表达基因的筛选通过语言“limmar”包[5]对芯片表达谱中每个探针进行检验和贝叶斯检验，差异表达基因以|log(foldchange)|>和调整的<0.05为筛选标准，来定义差异表达探针，负数代表下调，正数代表上调，通过GPL570平台将探针转换成基因名称，利用语言制作差异表达基因的热图和火山图[6]。
1.4关键基因及功能注释
将差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)导入在线分析工具STRING11.0(https://stringdb.org/)，分别通过Cytoscape3.7.1软件的CytoHubba插件、MCODE插件进行蛋白质相互作用(proteinproteininteraction，PPI)分析筛选标准：有效结合分数>0.4)、网络分析(CytoHubba根据nodes在网络中的属性进行排名，高degree的蛋白更倾向于是关键蛋白，因此以degree对节点进行排名、模块分析筛选标准：degree=2,nodescore=0.2,core=2,max.Depth=100)等种方式综合筛选关键基因(hubgene)。
接着对关键基因进行注释，包括基因本体论(geneontology，GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgnomes，KEGG)分析，GO分析划分为生物学过程(biologicalrocess,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、细胞组件(cellularcomponent,CC)个方面。通过软件“clusterProfiler”包[7]和“ggplot2”包[8]进行GO和KEGG富集分析和可视化。
1.5关键靶点对接及中药预测
将筛选出的关键基因与CoremineMedical(http://www.coremine.com/)相互映射，筛选出关键基因相关的中药，<0.05表示差异具有统计学意义。根据中药预测结果，从TCMSP(TraditionalChineseMedicineSystemspharmacology)数据库筛选其活性成分(口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18)，并获得上述活性成分的靶点信息，使用蛋白质数据库UniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)将其转换为统一基因名称。基于CytoHubba进行网络分析，通过MCC方法筛选排列前20的靶点并通过Cytoscape展示结果。
2结果
2.1数据预处理
箱式图结果显示各个样本中位数基本在一个水平线上，说明样本间归一化程度好。PCA图和UMAP图样本聚类情况显示当各组的样本分开，分组间差异明显，说明后续差异分析有意义的结果可能会比较多。过滤后最终汇总获取21655个基因表达水平数据。
2.2差异基因
基于GSE11882的基因片段原始数据，满足|log(foldchange)|>和调整的<0.05标准的差异基因有268个，其中包括246个下调基因和22个上调基因;下调和上调最显著的40个基因见2.3关键基因及功能注释对268个差异基因进行关键基因的筛选。
首先，在STRING数据库进行PPI分析，设置置信度>0.4，并下载相关TSV格式文件，得到PPI关系对文件;接着，使用Cytoscape软件的插件CytoHubba对其进一步分析，以发现复杂网络的关键目标和子网络;然后使用ytoscape软件的MCODE插件对其进行模块分析。结果显示，差异基因CytoHubba分析后依据degree定义前15个关键基因，MCODE分析后得到所得功能模块最大者由34个节点，334条边组成，score为20.242，该模块即为PPI网络中紧密联系的区域。分析差异表达基因后，构建了15个关键基因的PPI网络。
2.4关键靶点对接及中药预测
将关键基因映射到CoremineMedical数据库，筛选治疗脑老化的潜在中药(<0.05)，得到人参、三七、黄芪、丹参等多味中药，其中人参和三七味中药具有益气活血之功效，三七是PTPRC、TYROBP、VEGFA等多个关键基因映射的中药。多项研究表明，人参具有抗衰老[913]以及改善认知障碍和保护神经的作用[1419]，两者可能作为分子治疗药物的潜在来源，故筛选上述味中药构建“药物活性成分作用靶点”网络。
基于CytoHubba插件通过MCC方法筛选排列前20的靶点，并以不同色阶进行展示。人参和三七的药物活性成分参与调控PTGS1、PTGS2、核受体辅激活蛋白(NCOA2)、类视黄醇受体(RXRA)、β肾上腺素能受体(ADRB2)、心脏钠通道基因(SCN5A)等关键基因，可能成为治疗脑老化的潜在中药。
3讨论
研究表明，衰老是大多数神经退行性疾病的主要危险因素，它们与衰老的个生物学特征的关系如下：基因组不稳定性、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳定性丧失、线粒体功能障碍、细胞衰老、营养物质传感失调、细胞凋亡、干细胞衰竭和细胞间通讯的改变[3]。其中基因表达水平的改变在脑老化的发生发展中起着重要作用，有助于解释没有严重的组织病理学变化下的轻度认知衰退[20]。
尽管对于阿尔茨海默病等认知深度衰退条件下的基因表达变化开展了许多研究[2123]，但对于认知完好的人类大脑在正常成年寿命中发生的基因组变化却知之甚少。相关网络和差异表达生物信息学分析已应用于许多疾病，揭示了复杂的发病机制和新的生物标志物的诊断和治疗[2425]。通过对芯片的挖掘分析，可以更好地研究脑老化的中心生物学机制，进而发现治疗神经退行性疾病的新靶点和新药物。
3.1差异表达基因的功能与炎症免疫的信号通路密切相关
本研究提取芯片GSE11882，通过生物信息学方法分析，筛选差异表达基因268个，其中包括246个下调基因和22个上调基因，然后继续筛选出15个关键基因。为了明确关键基因之间的相互作用关系，MCODE分析后得到功能模块最大者由34个节点，334条边组成，提取PPI网络中连接最为紧密且位于重要节点位置的15个基因，分别是PTPRC、ITGAM、TLR2、TYROBP、CD86、ITGB2、CSF1R、C3AR1、VEGFA、CCR1、CCL4、CCL2、FCER1G、LCP2、CXCR4。其中，PTPRC和ITGAM发挥核心作用，PTPRC(又称CD45，白细胞共同抗原)是最丰富的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在所有有核造血细胞上均有表达，在调节免疫应答中发挥重要作用[26]。
研究表明，PTPRC基因缺失会加速脑淀粉样变，导致促炎和抗β吞噬的小胶质细胞活化[27]。ITGAM参与单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的各种粘附相互作用，以及介导补体包被颗粒和病原体的摄取[28]。在小胶质细胞中需要酪氨酸BP/DAP12来控制小胶质细胞超氧化物离子的产生，这些离子促进脑发育过程中发生的神经元凋亡[29]。研究表明，ITGAM作为微胶质基因在神经退化和大脑老化中起着重要作用[30]。GO分析表明关键基因参与的主要生物学过程为白细胞迁移、细胞趋化运动、小胶质细胞活化、神经炎症反应、免疫效应过程的调节等。在脑老化的发展和进程中，炎症老化和免疫衰老，这是生物老化的个特征[31]。
在成长过程中，免疫系统对塑造大脑至关重要，神经系统和免疫系统都会随着年龄的增长而变化[32]，而炎症是机体对任何损伤的基本保护性反应，随着年龄的增长，炎症水平逐渐升高，过度的炎症反应会导致神经元损伤[33]。研究表明，免疫衰老和炎症可能通过调节神经胶质细胞向更活跃的促炎症状态发展，从而促进神经炎症，导致神经保护功能丧失，导致神经功能障碍和脑组织损伤累积[34]。
因此，调节免疫衰老和炎症反应是治疗脑老化和神经退行性疾病的重要靶标。通过对关键基因的KEGG富集分析发现，通路主要涉及细胞因子细胞因子受体相互作用、PI3KAkt信号通路、Rap1信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、产生IgA的肠道免疫网络通路等，进一步表明的脑老化的发生发展与免疫过程和炎症反应关系密切。细胞因子是可溶性细胞外蛋白或糖蛋白，是细胞间重要的调节因子和动员因子，参与先天性和适应性炎症宿主防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成以及旨在恢复内稳态的发育和修复过程[35]。
它们可以影响几乎所有的生理系统，包括神经内分泌相互作用、神经递质代谢和神经可塑性，从而影响行为和认知功能。当小胶质细胞持续激活和随后促炎症介质的持续释放，和氧化应激的增加，活化的小胶质细胞诱导一氧化氮和促炎细胞因子，如ILβ、IL和肿瘤坏死因子(TNF)，导致神经炎症[36]。以及随着年龄的增长，功能失调的线粒体产生的活性氧和增加的NFκB信号增强了NLRP3炎症体，随后导致脑内ILβ的释放，导致衰老相关的慢性炎症反应[37]。
PI3KAkt信号通路涉及细胞增殖、新陈代谢、生长、分化、凋亡和其他生命现象的调节，可以通过调控细胞能量代谢感受器AMP激活蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和线粒体生物合成调控因子过氧化酶增殖因子活化受体γ共激活因子α(PGCα来调节大脑的能量代谢[38]。研究表明，激活PI3K/Akt信号通路可以改善老年痴呆症小鼠的神经炎症反应和认知障碍[39]。Rap1信号通路在细胞极性的形成、细胞增殖、分化和癌变、细胞黏附和运动等生物功能中起着至关重要的作用，近年来研究发现Rap1信号通路的紊乱会促进癌症的进展，Rap1的定位信号可能是控制癌症转移发展的方法[40]。
而对于神经系统，Rap1信号可调控神经极性建立、神经突生长、突触可塑性和神经元迁移等，最新研究发现Rap1是压力驱动神经元和行为病理学的关键调解者，并突出了Rap1对前额皮质功能障碍影响[41]。在产生IgA的肠道免疫网络通路中，IgA抗体作为对抗微生物的第一道防线，分泌的IgA通过将食物抗原和微生物包埋在粘液中促进免疫排斥，起到中和毒素和病原微生物[42]、调节肠道微生物群的组成、并在维持肠道微生物群和宿主之间的静态关系方面发挥作用[43]。
近年来“肠脑轴”的相互作用成为了研究热点，肠道微生物群的年龄相关变化，特别是物种多样性的减少，以及其它因素如肠道运动受损、肠道血屏障受损和免疫功能抑制，可能与年龄相关的神经退化有关[44]。有研究表明，人类脑膜含有IgA分泌的血浆细胞，脑膜IgA细胞代表一个关键的免疫屏障，可以防止病原体蔓延到脑膜影响中枢神经系统[45]。以上这些信号通路和参与调节的细胞因子可能作为脑老化以及神经退行性疾病预防及治疗的潜在靶点，值得进一步研究。
医学论文投稿刊物：《国际老年医学》创刊于1980年，由吉林大学主办。本刊为全国性正式期刊，属于国家医学学术类杂志。本刊遵循“洋为中用”以助我国老年医学事业发展的宗旨，主要报道国外有关老年医学的最新实用信息。以从事老年医学的临床、教学、科研工作者为对象。
4结论
通过对脑老化基因芯片的数据挖掘及生物信息学分析，筛选出PTPRC、ITGAM、TLR2等15个与脑老化关系密切的基因，发现炎症过程、免疫反应、PI3KAkt通路信号、产生IgA的肠道免疫网络通路等在脑老化过程中起着重要作用，显示脑老化的发生发展是多因素共同作用的结果。而人参、三七、黄芪、丹参等中药及其活性成分可能成为治疗脑老化的新药物，为后续脑老化分子机制及其药物的研究提供潜在靶标，未来仍需进一步的实验来验证关键基因和中药活性成分的潜在治疗作用。基因芯片技术与生物信息学方法为中医药学带来了新的契机，通过挖掘中药潜在的治疗靶点，为中医药的现代化研究提供新思路。
参考文献
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[7]YUG,WANGL,HANY,etal.clusterProfiler:anRpackageforcomparingbiologicalthemesamonggeneclusters[J].Omics,2012,16(5):284.
作者：吴丹，王雪，杨静，吴烨，刘逸南，修成奎，王佳丽，刘奕清，雷燕
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