芡实SBE3基因克隆及其生物信息学分析

　　摘要芡实淀粉是芡实品质的重要载体，淀粉分支酶SBE3能够调控支链淀粉的合成，为了深入研究芡实SBE3基因的功能与调控机制，本研究克隆出芡实淀粉分支酶SBE3基因并对其进行相关生物信息学分析。通过提取芡实种子总RNA，采用RTPCR方法克隆芡实SBE3基因，利用软件和在线网站对该基因及其编码氨基酸序列的理化性质、蛋白质结构、系统发育树和启动子等进行生物信息学分析与预测。获得EfSBE3基因全长2830bp，开放阅读框长2736bp，编码911个氨基酸;预测其为亲水性蛋白，无跨膜区，无信号肽。系统进化分析表明该序列与同科植物睡莲亲缘关系最近，启动子分析共预测出10类顺式作用元件。本研究结果可为芡实分子育种提供理论依据。

　　关键词芡实EuryaleferoxSalisb.);SBE3;基因克隆;生物信息学分析

　　芡实为睡莲科水生草本植物芡EuryaleferoxSalisb.)的干燥成熟种仁，既是传统中药材，也是常见的食品材料，具有益肾固精，补脾止泻，除湿止带的功效宋晶和吴启南,2010)。芡实中淀粉所占比重最大，达到70%以上。淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉构成，直链淀粉与支链淀粉的比例以及支链淀粉的结构能够决定淀粉的性质(Linetal.,2019)，支链淀粉特性对芡实品质调控起重要作用。本研究基于前期转录组数据，筛选出不同品种芡实与淀粉合成途径相关的差异基因SBE3。

　　淀粉分支酶(strarchbranchingenzyme,SBE)能够催化直链淀粉变为支链淀粉，在葡聚糖链上引入α1,6糖苷键，使其产生分支结构，是合成淀粉分支的关键酶刘玉汇等,2010)，对于淀粉的合成过程至关重要(Dumezetal.,2006)。植物淀粉中的SBEs可以分为个大类：SBEI型和SBEII型，SBEII型中存在种同工酶SBE3(SBEIIb)和SBE4(SBEIIa)，SBEIIa在植物体内广泛表达，而SBEIIb主要在发育中的胚乳里表达(Gorenetal.,2018)。在淀粉合成延伸阶段中，与SBEIIa相比，SBEIIb倾向于转移更短的链(Mizunoetal.,2001)。目前已在拟南芥Arabidopsisthaliana、水稻Oryzasativa、玉米Zeamays和甘薯Ipomoeabatatas等多种植物中鉴定并克隆出SBE3基因(Hanetal.,2007;Yanetal.,2009;Peietal.,2015)。

　　SBEIIb基对胚乳中支链淀粉的精细结构和淀粉结晶结构的形成起着特殊的作用，同时对淀粉内部的颗粒结构也有一定的影响(Nakamuraetal.,2020)。芡实SBE1基因已被证实，其表达变化与不同品种芡实的支链淀粉差异相关徐旭等,2019)，但对于芡实中的其他类型淀粉分支酶相关研究仍较为缺乏。本研究结合课题组芡实转录组与芡实基因组数据，采用RTPCR克隆芡实中的SBE3全长序列，对该基因的开放阅读框和氨基酸序列进行相关的生物信息学分析。以期为研究SBE3的功能及体内表达，揭示芡实品质形成机制以及芡实的分子育种研究提供理论基础。

　　1结果与分析

　　1.1芡实SBE3基因克隆及序列分析

　　电泳结果显示28S和18S的条带清晰完整，无弥散拖尾等现象，说明芡实种子RNA质量可靠，没有发生降解，可以用于下一步实验。将逆转录后的cDNA第一链作为模板，进行全长扩增，电泳结果显示在约3000bp处出现目标条带。

　　将目的条带进行胶回收纯化，胶回收产物经连接转化后进行测序，得到全长为2830bp的芡实SBE3基因序列，与预期大小基本一致，命名为EfSBE3。将SBE3基因的全长序列在NCBI数据库进行blastx比对后发现，该序列与蓝星睡莲Nymphaeacolorata的SBE3基因同源性最高，相似性达到91.59%。利用NCBI的ORFfinder查询，发现其包含一个长为2736bp的开放阅读框(openreadingframe,ORF)。

　　1.2EfSBE3编码蛋白的理化性质分析

　　通过NCBI中的ConservedDomain搜索后发现该编码的蛋白质具有α淀粉酶保守结构域(223~2733)属于PLN02960家族，PLN02960被归类为一种可能跨越多个域的结构域，是超家族cl33608的唯一成员。利用ExPASyProtParam软件对EfSBE3基因编码氨基酸序列的理化性质进行在线分析，预测其分子式为476272061272137041，相对分子质量为105509.76，半衰期较长，为30h，等电点为5.97，脂肪族氨基酸指数为75.02，不稳定系数为41.76，属于不稳定蛋白。在氨基酸组成中，亮氨酸(Leu)含量最高为9.20%，此外含有8.00%的谷氨酸(Glu)和7.00%的甘氨酸(Gly)等，其中包括130个负电荷残基(Asp+Glu)和112个正电荷残基(Arg+Lys)。

　　1.3EfSBE3编码蛋白的亲疏水性、跨膜结构和信号肽

　　利用ExPasyProtScale软件在线预测编码蛋白的亲疏水性，结果显示EfSBE3编码蛋白的出现在最高值第500个氨基酸处为2.578;在第70个氨基酸处出现最低值为3.756，平均疏水性为0.490，亲水性强，故推测该蛋白为亲水性蛋白，与前文理化性质中的预测结果类似。通过TMHMM2.0在线软件预测EfSBE3编码蛋白序列有无跨膜螺旋结构，预测结果表明该蛋白不存在跨膜结构。在线软件SignalP4.1信号肽预测分析结果显示，得分最高为0.111，得分最高为0.108，得分最高为0.177，表明EfSBE3编码氨基酸中不含信号肽，从而推测其为非分泌蛋白。

　　1.4EfSBE3编码蛋白的糖基化位点和磷酸化位点

　　使用NetNGlyc1.0软件，EfSBE3编码蛋白预测各值得分均小于0.5，说明无可能的糖基化位点。通过NetPhos3.1软件在线预测，编码蛋白中共发现140个可能存在的磷酸化位点，其中共分析出82个特异性激酶位点，包括58个丝氨酸(S)、16个苏氨酸(T)、个酪氨酸(Y)。参考蛋白激酶分类(Ho,2014)，特异性激酶共有15种，包括属于ACG组的以环腺苷酸(cAMP)依赖的蛋白激酶PKA、环鸟苷酸(cGMP)依赖的蛋白酶PKG及钙和磷脂依赖的蛋白激酶PKC以及近亲激酶PKB，属于CMGG组的作用于下游的磷酸化级联系统的CK2，GSK3，p38MAPK，cdk5和cdc2，属于传统PTK组的EGFR以及其他植物蛋白激酶如INSR等。

　　2讨论

　　已有研究表明，通过抑制SBE3基因的表达，可以使水稻中的直链淀粉含量增加(Weietal.,2010);而将SBE3anti转入水稻中，直链淀粉含量有所降低赵江红,2007)，SBE3基因在淀粉的合成尤其是支链淀粉的合成中起重要作用。为了探索芡实中SBE3的基因调控功能，解释芡实淀粉特性的形成机制，本研究通过芡实转录组数据设计引物，获得的EfSBE3的cDNA序列全长为2830bp，具有一个长为2736bp的完整的开放阅读框，编码有911个氨基酸，包含个α淀粉酶保守结构域。SBEs由中部的(β/α)桶装区域或域，个氨基末端结构域和个羧基末端结构域组成(Abadetal.,2002);并预测其编码氨基酸为不稳定的亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽，不存在糖基化位点，含有140个磷酸化位点。

　　磷酸化是一种植物体内常见的蛋白质翻译后修饰方式，能够参与植物的非生物胁迫及激素调控刘静等,2021)。SBEs与其他参与淀粉合成的酶能够形成异质蛋白复合物，这些蛋白复合物的组装由蛋白磷酸化调控TetlowandEmes,2014)，所预测出磷酸化位点为研究芡实的表面修饰提供参考。本研究通过多序列比对可知，EfSBE3基因具有较强的保守性，有多个特征保守区域在序列中包含“EDAT”的SBE3特征氨基酸序列，而在SBEI和SBEII基因中该区域为“EDVS”氨基酸序列(KeelingandMyers,2010)，有助于开展EfSBE3基因的功能的深入研究。通过构建系统发育树发现，芡实的SBE3基因能够较好的与同为睡莲科的种睡莲聚为一支，推测SBE3基因在睡莲科植物的进化过程中可能高度保守，为今后深入研究睡莲科植物的进化行为提供参考。

　　本研究从启动子区域中共预测出无氧诱导顺式调节元件、MeJA反应顺式调控元件、参与脱落酸反应的顺式元件等10类作用元件;预测结果提示，当开展激素对芡实支链淀粉特性进行调控的相关研究时，可优先考虑选择茉莉酸甲酯、脱落酸和赤霉素。ARE，MBS，TCrich等胁迫响应元件表明它们可能在应对非生物胁迫中发挥潜在作用。这些植物相关顺式作用元件为后续深入研究SBE3表达调控及环境胁迫影响提供了方向上的参考李濯雪和陈信波,2015)。

　　抗性淀粉作为淀粉中不能被人体消化的部分，在大肠中成为发酵的底物(BelloPerez,etal.,2020)。已有研究表明食用抗性淀粉有助于维持人体健康，改善多种疾病(DeMartinoandCockburn,2020)。在水稻SBE3基因中已发现一个控制水稻抗性淀粉合成的突变(Yangetal.,2012)，利用基因编辑技术编辑SBE3基因后，可以获得具有高含量抗性淀粉的水稻白建江等,2018)。上述研究表明通过基因调控，可以改变淀粉特性，获得具有高含量抗性淀粉的植株。本研究对芡实SBE3基因跨膜结构和蛋白结构进行预测，并对其保守序列和启动子顺式元件开展分析，为今后深入挖掘该基因的基因功能以及转录因子的调控，调节芡实淀粉特性，开展芡实基于淀粉的分子优良育种提供了一定的理论依据。

　　3材料与方法

　　3.1实验材料及试剂

　　芡实种子采集自江苏省高邮市界首镇芡实种子种苗基地(33°00′N,119°41′E)，经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为睡莲科植物芡EuryaleferoxSalisb.)的种子，经液氮快速冷冻后，保存于80℃，备用。RNA提取试剂盒、高保真酶及pMD19克隆载体购于大连宝生物科技有限公司;cDNA逆转录试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司;DNA凝胶回收试剂盒购于赛默飞世尔科技中国有限公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞购于北京天根生化科技有限公司;2×EasyTaqMix购于北京全式金生物技术有限公司;引物合成和测序技术服务由生工生物工程上海股份有限公司提供。

　　3.2芡实种子总RNA的提取和cDNA第一链的合成芡实样品的总RNA提取参照TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtraction试剂盒中的多糖多酚组织提取操作进行。cDNA第一链合成按照HiScript®II1stStrandcDNASynthesis试剂盒操作进行。

　　3.3芡实SBE3基因克隆

　　基于CoGe数据库中的芡实基因组数据，结合课题组前期芡实转录组数据比对，获得SBE3基因序列，利用PrimerPremier5.0软件进行SBE3基因特异性引物设计(F:ATGGCCGTTGATTCTTCTTCGTT;R:CATCGGTACTCGCAGGAGCTTTC)。扩增体系总体积为25μL，包括高保真酶12.5μL，上游和下游引物共0.75μ，芡实种子cDNA2μL，灭菌水9.75μL，PCR反应的条件为：94℃预变性5min;98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min;共35个循环，72℃保持10min，4℃保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用TheGeneJETGelExtraction试剂盒胶回收纯化，并通过pMD19载体进行载体连接转化至DH5α感受态细胞，培养单菌落，利用菌落PCR筛选阳性克隆送上海生工有限公司测序。

　　植物论文投稿刊物：《分子植物育种》(Molecular Plant Breeding)杂志创刊于2003年，由国家科技部批准，国家新闻出版署核准，海南省生物工程协会主办，海南省科学技术会主管，国内统一刊号：46-1068/S，国际标准刊号：1672-416X，邮发代号：84-23，单月28日出版。

　　参考文献：

　　AbadM.C.,BinderupK.,RiosSteinerJ.,ArniR.K.,PreissJ.,andGeigerJ.H.,2002,TheXraycrystallographicstructureofEscherichiacolibranchingenzyme,J.Biol.Chem.,277(44):4216442170.

　　BaiJ.J.,ZhangJ.M.,PiaoZ.Z.,FangJ.,LiG.S.,WangY.,andYangR.F.,2018,ObtainofnewricevarietywithhighresistantstarchbasedontheeditionofriceSBE3genebyCRISPR/Cas9system,FenziZhiwuYuzhong(MolecularPlantBreeding),16(5):15101516.

　　(白建江,张建明,朴钟泽,方军,李刚燮,王亚,杨瑞芳,2018,应用CRISPR/Cas9系统编辑水稻SBE3基因获得高抗性淀粉水稻新品系,分子植物育种,16(5):15101516.)

　　BelloPerezL.A.,FloresSilvaP.C.,AgamaAcevedoE.,andTovarJ.,2020,Starchdigestibility:past,present,andfuture,J.Sci.FoodAgric.,100(14):50095016.DemartinoP.,andCockburnD.W.,2020,Resistantstarch:impactonthegutmicrobiomeandhealth,Curr.Opin.Biotechnol.,61:6671.

　　DumezS.,WattebledF.,DauvilleeD.,DelvalleD.,PlanchotV.,BallS.G.,andD'HulstC.,2006,MutantsofArabidopsislackingstarchbranchingenzymeIIsubstituteplastidialstarchsynthesisbycytoplasmicmaltoseaccumulation,PlantCell,18(10):26942709.

　　GorenA.,AshlockD.,andTetlowI.J.,2018,Starchformationinsideplastidsofhigherplants,Protoplasma,255(6):18551876.HanY.,SunF.J.,RosalesMendozaS.,andKorbanS.S.,2007,Threeorthologsinrice,Arabidopsis,andPopulusencodingstarchbranchingenzymes(SBEs)aredifferentfromotherSBEgenefamiliesinplants,Gene,401(12):123130.HoH.L.,2014,Plantproteinkinaseandproteinproteininteraction,J.Biodivers.Biopros.Dev.,2(1):1000142.

　　作者：王前严洪楷邵永芳景宗慧刘莉成鲍锞吴啟南

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