本文摘要：摘要：目的基于成分反映活性，活性指向功效的中药质量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等级评价的二分类Logistic模型，并开发出一种柴胡等级评价计算器。方法采用二分类Logistic算法将柴胡的柴胡皂苷a、d含量、环氧化酶2(COX2)生物效价、ABTS+清除率、DPPH
摘要：目的基于“成分反映活性，活性指向功效”的中药质量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurumchinense等级评价的二分类Logistic模型，并开发出一种柴胡等级评价计算器。方法采用二分类Logistic算法将柴胡的柴胡皂苷a、d含量、环氧化酶2(COX2)生物效价、ABTS+清除率、DPPH∙清除率和羟自由基清除能力等指标进行关联分析，建立用于柴胡的等级预测模型，并进行验证。采用多元回归分析方法、二分类Logistic回归模型结合柴胡成分药效相关数据，建立等级评价方程。采用JavaScript和CSS3技术，将等级评价方程嵌入HTML进行计算器插件的开发。结果Logistic预测模型概率公式初步将15个产地来源柴胡最终分为优、良、中、差4级，各批次所对应的预测归属等级明确，拟合概率P值均大于90%。开发了一种无需将数据传给服务器端，通过动态地输入测定的数据，可直接输出柴胡等级评价结果的计算器。结论首次将柴胡功效成分相结合，建立评价柴胡质量等级的方法，可为柴胡质量评价提供重要依据;并开发出一种基于“药效成分”相关联的柴胡质量等级快速评价的计算器插件。
关键词：柴胡;药效论质;等级评价;中药;质量控制;主成分分析;Logistic算法;计算器;柴胡皂苷;环氧化酶2;生物效价;ABTS+;DPPH∙;羟自由基;多元回归分析
柴胡BupleuriRadix(BR)为伞形科柴胡属植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡具有解热、保肝、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗抑郁等多种药理活性[2]。药用植物资源丰富、分布广，临床应用常以北柴胡为主，且长期以来在民间传统医学中用作消炎药、解热药和镇痛药[3]。主要分布于我国东北、华北、西北、华东和华中各地。目前，柴胡质量控制主要参考《中国药典》2020年版，以单一成分柴胡皂苷a、d含量作为主要质控指标。其混淆品小叶黑柴胡的柴胡皂苷a、d含量也符合《中国药典》2020年版[4]。
因此，单一成分并不能全面地反映药材内在质量，且中药的化学物质实体与生命体分子网络的交互作用具有模糊性、难以定量等特点[5]。故需要根据成分与药效间多维度、多层次的相互作用对柴胡质量进行全方位评价。 目前，柴胡只有选货和统货的区别，随着野生资源的减少，药材市场上以栽培品为主，造成品种混乱，质量参差不齐，无明确区分柴胡质量等级的方法，若以柴胡皂苷a、d含量高低对市场上的柴胡进行分类可能具有一定的片面性，故将柴胡主要活性成分及药效作为评价指标，其中柴胡皂苷a、d质量分数较高，具有良好的抗炎活性[68]。
已有研究表明[9]环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是柴胡抗炎作用机制之一，它是花生四烯酸代谢和多种炎症介质(前列腺素和血栓素A2)生物合成过程中重要的限速酶之一，具有2种亚型即COX1和COX2。COX1是机体固有的酶，在正常情况下存在于胃肠道、肾脏和血小板等组织细胞，不能被诱导增加，通过促进前列腺素及血栓烷A2的合成，发挥保护胃黏膜、维持肾血流量、调节血小板聚集、外周血管张力等内环境稳定的作用。
而大多数细胞中不出现COX2，可在生长因子、细胞因子、细胞毒素、致炎物质等刺激下表达，产生的底物前列腺素可引起炎症、疼痛、发热反应，这与柴胡传统应用于抗炎解热的作用相符合[10]。因此，通过测定对COX2的抑制作用，可用于评价柴胡抗炎活性。除此之外，柴胡在抗氧化方面具有较强的药理作用[1112]。研究表明，氧化应激和炎症被认为是各种疾病病理的核心机制，持续活跃的炎症反应可导致活性氧的过度产生，诱导氧化应激，使细胞受到氧化损伤，同时产生炎症。
因此，将氧化应激和炎症与柴胡成分结合用于综合评价柴胡质量，具有高度的代表性。故本研究对不同批次柴胡中的柴胡皂苷a、d含量及COX2的生物效价和抗氧化效果进行测定[13]，通过Logistic算法建立模型并进行验证。本课题组前期对相关药材等级评价[1415]积累了丰富经验，建立了以“成分体外效价等级品质”网络为反映体系的分级体制[1718]，可对不同产地来源的柴胡进行等级分类，为柴胡质量评价研究提供依据;并开发出一种柴胡质量等级快速评价的计算器插件，为拓宽中药质量等级快速评价方法提供参考。
1仪器与试药
1.1仪器Agilent1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司;FW400AD型高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司;KQ300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;MultskanGo酶标仪，美国赛默飞世尔公司;SartoriusCPA225D十万分之一电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司。
1.2材料对照品柴胡皂苷a(批号110777201912，质量分数≥98%)、柴胡皂苷d(批号110778201912，质量分数≥98%)，购自中国食品药品检定研究院;总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)、羟自由基(OH·)测试试剂盒、DPPH自由基(DPPH·)清除能力试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;环氧化酶2(COX2)抑制剂筛选试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。柴胡主要收集于陕西省，经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为伞形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1供试品溶液的制备[1]将药材粉碎，过四号筛，精密称定0.50g药粉，加入含有5%浓氨水的甲醇溶液25mL，超声30min，滤过，滤液用25mL甲醇洗涤药渣2次，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5mL量瓶中，即得。
2.1.2对照品溶液的制备精密称定柴胡皂苷a或d适量，加甲醇溶解，分别制成含1.03mg/mL柴胡皂苷a及1.08mg/mL柴胡皂苷d的溶液，即得。
2.2色谱条件色谱柱为Agilent5TCC18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相为水乙腈，梯度洗脱：0～50 min，25%～90%乙腈;50～55min，90%乙腈;55～57min，90%～25%乙腈;进样体积10μL;体积流量1mL/min;柱温30℃;检测波长210nm。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察
分别精密移取“2.1.2”项下柴胡皂苷a、d的对照品溶液，稀释成2、4、8、16、32倍，按“2.2”项下色谱条件进样测定。以进样量为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归分析。所得柴胡皂苷a回归方程为Y=2702X+105.2，r=0.9999，表明线性关系良好，线性范围0.032～1.030mg/mL;柴胡皂苷d回归方程为Y=3020X+63.75，r=0.9998，表明线性关系良好，线性范围0.033～1.080mg/mL。
2.3.2精密度考察
吸取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续测定6次，结果显示柴胡皂苷a、d峰面积RSD分别为0.22%、0.63%，表明该仪器精密度良好。
2.3.3稳定性考察
按“2.1.”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、16、24h时，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果显示间隔进样所测得柴胡皂苷a、d峰面积的RSD分别为2.00%、2.94%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好2.3.4重复性考察按“2.1.”项下方法制备份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示柴胡皂苷a、d峰面积的RSD分别为1.46%、2.31%，表明方法重复性良好。
2.3.5加样回收率考察
取柴胡皂苷a、d含有量已知的同一批样品(S2)约1g，称取6份，精密称定，分别加入与样品中柴胡皂苷a、d含量相等的对照品，再按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算加样回收率。测得柴胡皂苷a、d的平均加样回收率分别为98.90%、100.17%，RSD分别为2.35%、2.27%，表明回收率良好。
2.4含量测定
各批次柴胡，按“2.1.1”项下制样方法平行制备3份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，计算柴胡皂苷a、d的含量。各批次柴胡中柴胡皂苷a、d的含量。除S15批次柴胡外，其他所有批次柴胡皂苷a、d含量均符合《中国药典》2020年版的规定。
2.5柴胡抑制COX2活性评价
2.5.1对照品溶液的制备
精密移取COX2试剂盒中塞来昔布适量，加COX2试剂盒中缓冲液溶解，用缓冲液将阳性对照品塞来昔布稀释成6.25、12.5、25、50、100nmol/L的溶液作为对照品溶液。
3小结
3.1柴胡等级划分与性状指标的关系
柴胡作为临床常用中药材，具有较高的药用价值，但目前记载的柴胡道地产区过多、没有科学指导下培育的移栽品、次品与伪品充之都将造成柴胡药材市场上品种混乱，导致质量参差不齐，在性状上难以分辨真伪。传统经验鉴别方法是药材鉴别的精髓，方法虽好，但需要专业型人才，而且药材品种繁多，形态各异，尤其药材经炮制加工后改变其形状、性味，使药材更加难以鉴别。
因此单纯的依靠传统经验鉴定药材真伪、确定优劣显然是不够可靠。故本实验利用PCA对复杂信息中的多变量进行快速提取、重新组合、数学降维，生成新的综合变量即主成分，经投影处理后，样本最终落在主成分组成平面上的位置，即可表征不同样本的总体信息。通过Logistic进行分析，寻找规律建立数学模型，进而综合评价药材质量。多变量大数据集无疑会为研究和应用提供丰富的信息，把现代科学和实践经验加以结合，一定能更好地判断药材的优劣，弥补传统经验之不足，保证临床用药安全有效。
3.2柴胡等级划分与生物活性的关系
质量直接影响中医临床疗效，故应以“因效而异”为原则对柴胡质量进行评价。但对于柴胡活性成分药效差异的研究相对较少[2325]。目前，药物主要成分与活性相结合的研究已成为评价药物品质的方法之一，故本实验将柴胡成分药效相关联。用于柴胡等级评价。
通过柴胡对COX2的生物效价研究结果显示，各批次柴胡样品间抗环氧化酶活性差异较大，柴胡质量浓度在3.125～25mg/mL对COX2抑制作用具有明显的量效关系，建议增加柴胡抗环氧化酶活性作为柴胡质量的区别要点。Logistic模型回归对所得预测模型准确性进行了考察，等级归属和各个等级间参数范围明确，结果表明预测能力良好。本研究首次将柴胡中相关有效成分含量与体外效价相关联，建立柴胡等级分类体系，具有一定应用价值。同时也存在一定局限性：样本量少，柴胡样本量仅限于柴胡道地产区陕西境内;为进一步完善柴胡等级研究，后续将扩大样本来源。
3.3药材等级计算器开发
本计算器基于JavaScript的web交互跨平台技术，该应用需求也越来越多，JavaScript编辑的交互web页面改变了传统的www访问模式，它把JAVA嵌入在HTML中，无需通用网关接口(commongatewayinterface，CGI)即可实现动态交互，既能满足用户对灵活性和方便性的要求，又能对用户提出的要求进行快速响应。
因此，本计算器针对中药等级评价和“成分功效”关联计算困难的问题，设计了一种基于HTML5的用于中药等级计算的可视化交互系统，能够快速、高效地进行中药等级计算并输出简明的评价结果。该计算器可独立使用，也可作为网络插件嵌入大型运算平台使用。其特点是将多个中药的生物活性数据和质控成分含量数据作为等级评价依据，采用多元回归分析方法联用Logistic回归模型，通过大量数据拟合出特定药材的等级评价方程。通过动态地输入测定的数据，可直接经过后台计算最终输出药材的等级评价结果，这样既减少了参数选择的尝试过程，又为准确性提供了保证。
参考文献
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[2]孙婷婷,骆骄阳,徐媛媛,等.柴胡药材质量国际标准现状概述[J].中国中药杂志,2020,45(20):48534860.
[3]LinM,ZhangW,SuJ.ToxicpolyacetylenesinthegenusBupleurum(Apiaceae)distribution,toxicity,molecularmechanismandanalysis[J].JEthnopharmacol,2016,193:566573.
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[5]许海玉,侯文彬,李珂,等.基于整合药理学的中药质量标志物发现与应用[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(6):18.
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作者：常百金1,2，唐志书1,2,3*，邱智东1*，刘妍如2，宋忠兴2，贾艾玲1
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