本文摘要：摘要：本试验采用超声辅助回流法提取川椒有效抑菌成分，以彩绒革盖菌和密粘褶菌的菌丝生长抑制率为指标进行提取工艺的优化。采用了响应面分析法确定川椒提取的最佳工艺条件，同时探讨了液料比、乙醇浓度、提取时间和温度间的显著性影响和交互作用。当乙醇浓度95%，液料
摘要：本试验采用超声辅助回流法提取川椒有效抑菌成分，以彩绒革盖菌和密粘褶菌的菌丝生长抑制率为指标进行提取工艺的优化。采用了响应面分析法确定川椒提取的最佳工艺条件，同时探讨了液料比、乙醇浓度、提取时间和温度间的显著性影响和交互作用。当乙醇浓度95%，液料比12∶1，超声时间40. 00 min，超声温度45. 0℃，对彩绒革盖菌生长抑制率为26. 35%;当乙醇浓度95%，液料比20∶1，超声时间53. 00 min，超声温度65. 0℃，对密粘褶菌生长抑制率为66. 13%;当乙醇浓度95%，液料比20∶1，超声时间59. 00 min，超声温度65. 0℃，彩绒革盖菌生长抑制率为21. 39%，密粘褶菌生长抑制率为63. 54%。
关键词：川椒;响应面法;彩绒革盖菌;密粘褶菌;菌丝生长速率法
木材力学性能好、利于加工及可再生等优势使木材在多个领域应用广泛[1]。但木材作为一种生物质材料，易受到微生物的侵蚀，引起其理化性能的改变，影响木材的正常使用，高效低毒的环境友好型木材防腐药剂是现在木材防腐研究的重点和发展的方向[2-3]。川椒为芸香科植物青椒(香椒、青花椒、山椒、狗椒)(Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc.)或花椒(蜀椒、川椒、红椒、红花椒、大红袍)(Zanthoxylumbungeanum Maxim.)的干燥成熟果皮[4]。
研究证实，川椒提取物中含有多种抑菌活性成分，如挥发油、酰胺、生物碱、黄酮类等成分[5-9]，具有广谱抑菌作用。目前，有研究表明川椒提取物中的挥发油等活性成分能够能降低细胞膜的完整性，抑制孢子萌发，抑制真菌生长[10]。因此，川椒提取物适合作为一种环境友好型生物抑菌剂。本研究以川椒为研究对象，以引起木材白腐的彩绒革盖菌(Trametes versicolor(L.)Lloyd)和引起木材褐腐的密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum(Pers.)Murrill)作为供试菌种，以提取物对菌丝生长抑制率为指标，采用单因素试验确定了乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度等因素的最优提取条件[11]，并采用 CCD 响应面法设计试验并进行了川椒提取工艺的优化与分析。
木材加工论文：植物源木材防腐剂增效技术研究进展
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
1. 1. 1 材料川椒购买于呼和浩特市国大药房，原产地为四川省，生产日期为 2018年 9月，执行标准为《中国药典》(2015版)，实验室阴干，粉碎后过80目筛备用。供试菌种：彩绒革盖菌，菌种购于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所;密粘褶菌，菌种购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，均经实验室培养活化放置恒温恒湿箱备用。主要试剂：无水乙醇(分析纯)、葡糖糖、琼脂。
1. 1. 2 仪器和设备TGCXZ-2B 超声循环提取机，北京弘祥隆生物技术股份有限公司;BSC-250恒温恒湿培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;YTSP-840超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 川椒提取物的带毒培养基的制备川椒粉碎后过筛，超声提取后抽滤分离，进行索氏抽提，经旋转蒸发后去除多余溶剂，得到川椒提取物浸膏，取一定量浸膏加入到冷却至40℃~50℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中，摇匀后倒入培养皿中，冷却备用。
1. 2. 2 川椒提取物的抑菌活性测定试验采用生长速率法[12]测定川椒提取物对2种常见木材腐朽菌的菌丝生长抑制作用。用直径为4mm 的打孔器取无菌水培养菌落边缘菌饼，将菌饼反向移植在带毒培养基中心培养，每种试样设 3 次重复。将接种后培养皿放置在温度为 28℃，湿度80%的恒温恒湿箱中培养。从第3天起开始记录菌落直径。菌丝生长抑制率按照以下公式进行计算：菌落生长直径(mm)=两次直径平均值−4. 0(菌饼直径)菌丝生长抑制率=(对照菌落生长直径−处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100%。
1. 2. 3 超声辅助回流法提取川椒单因素试验按照试验设计，分别研究乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度对川椒提取物抑菌效果的影响：乙醇浓度浓度为55%、65%、75%、85%、95%;液料比为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1;超声时间为 20. 00min、30. 00 min、40. 00 min、50. 00 min、60. 00 min;超声温度为25. 0℃、35. 0℃、45. 0℃、55. 0℃、65. 0℃。其中，在进行乙醇浓度、液料比、超声时间试验时，带毒培养基的含药浓度为25 mg/mL，在进行超声温度试验时，带毒培养基浓度降低为15 mg/mL。
1. 2. 4 响应面法优化川椒抑菌物质提取工艺根据上述单因素试验结果，以乙醇浓度、液料比、超声时间超声温度4个因素为变量，以菌丝生长抑制率为响应值，结合 Central Composite 设计原理，采用 4 因素 5 水平响应面分析法进行试验设计，利用 Design expert(V8. 0. 6)进行试验，此时设置带毒培养基浓度为10 mg/mL，测定第3天时提取物培养基的抑制率。
2 结果与分析
2. 1 单因素试验结果
2. 1. 1 乙醇浓度对川椒提取液抑菌效果的影响由图1可知，乙醇浓度为95%时，彩绒革盖菌的抑菌效果最好。出现该现象的原因是随着乙醇浓度的增加，溶剂的极性逐渐变大，脂溶性成分(如挥发油、脂类、萜类等)逐渐增多，抑菌效果逐渐增强[13]。以浓度为 100%乙醇作为浸提溶剂时，提取液对密粘褶菌的抑制率仅增加了 3. 88%，对彩绒革盖菌的抑制率降低了 20. 18%，这可能是由于乙醇浓度越高溶出的物质也越多，但随着浓度的增加，杂质也溶出来，影响抑菌效果[14]。因此，后续试验选取95%乙醇作为浸提溶剂。
2. 1. 2 液料比对川椒提取液抑菌效果的影响不同液料比对川椒提取液的抑菌影响结果。液料比在 5∶1~15∶1之间时，抑菌效果随着液料比的增加而增加，这可能是由于川椒粉末和乙醇溶液中的浓度差变大，提取物的扩散空间扩大，扩散速度加快，使川椒中的有效抑菌物质更加易于溶解出来，抑菌效果越好[15];当液料比增加到20∶1时，一些非抑菌物质也逐渐扩散到溶剂中，影响提取物的抑菌效果[16]。因此，选择最佳液料比为15∶1。
2. 1. 3 超声时间对川椒提取液抑菌效果的影响超声时间对川椒提取液的抑菌影响结果。川椒提取物的抑菌效果随提取时间的增加而持续加大。这是由于超声作用时间越长，破碎效用愈强劲，细胞的受损度就愈高，有效成分溶出就越多[17]。考虑实际仪器的安全使用，选择超声时间60min进行后续试验。在乙醇浓度为 95%，液料比 15∶1，超声时间60. 00 min的提取条件下，川椒提取液带毒培养基浓度为 25 mg/mL 时，密粘褶菌的抑制率已经达到了88. 14%，为了更好的确定超声温度对抑制率的影响，后续试验带毒培养基的浓度降低为15 mg/mL。
2. 1. 4 超声温度对川椒提取液抑菌效果的影响超声温度对川椒提取物的抑菌效果的影响，提取物的抑菌效果在 25. 0℃~55. 0℃时，随着温度的升高而增加，川椒中有效抑菌成分的溶解扩散速度加快，溶出成分逐渐增多，抑菌效果逐渐增加[18]。当超声温度到达 65. 0℃时，提取物对密粘褶菌的抑制效果出现了轻微减弱，这可能是由于温度升高，对密粘褶菌有抑制作用的部分活性物质受热失活，抑制效果减弱[19]。超声温度 55. 0℃时，提取液中有效成分溶出较多对2种木材腐朽菌的抑制效果较好，因此选用 55. 0℃作为最佳超声提取温度。
2. 2 响应面试验结果
根据上述单因素试验结果，以乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度4个因素为变量，以菌丝生长抑制率为响应值，结合 Central Composite 设计原理，采用 4因素 5水平响应面分析法进行试验设计，利用 Design expert(V8. 0. 6)进行优化分析。
川椒提取响应面试验，以彩绒革盖菌生长抑制率和密粘褶菌生长抑制率2个值为响应值。经过软件对川椒提取液菌丝生长抑制率曲面模型的分析，有如下结果：当不考虑密粘褶菌生长抑制率，以彩绒革盖菌生长抑制率为最大值时，最优工艺条件为乙醇浓度为 95%，液料比为 11. 68∶1，超声时间为40. 00 min，超声温度为 45. 0℃，预测彩绒革盖菌生长抑制率达到最大值为 25. 47%;当不考虑彩绒革盖菌生长抑制率，以密粘褶菌生长抑制率为最大值时，最优工艺条件为乙醇浓度为95%，液料比为 20∶1，超声时间为 52. 52 min，超声温度为 65. 0℃，预测密粘褶菌生长抑制率达到最大值为 67. 92%;同时以彩绒革盖菌生长抑制率、密粘褶菌生长抑制率为最大值时，最优工艺条件为乙醇浓度为 95%，液料比 为 20∶1，超 声 时 间 为 58. 90 min，超 声 温 度 为65. 0℃，预测彩绒革盖菌生长抑制率达到最大值为2 0. 5 9%，预测密粘褶菌生长抑制率达到最大值为64. 61%。2. 3 最佳工艺条件的验证试验为了验证响应曲面结果的可靠性，根据实际实验设备及条件，将得到的优化工艺条件修正为：乙醇浓度为 95%，液料比为 12∶1，超声时间为 40. 00min，超声温度为 45. 0℃，此时预测彩绒革盖菌生长抑制率达到最大值为 25. 47%，按照此工艺条件进行 3 次平行验证试验。
实际平均彩绒革盖菌抑制率值为 26. 35%，比预测值高0. 88%，相对标准偏差(RSD)值为0. 84%。当乙醇浓度为 95%，液料比为 20∶1，超声时间为 53. 00 min，超声温度为 65. 0℃，预测密粘褶菌生长抑制率达到最大值为 67. 92%，按照此工艺条件进行 3 次平行验证试验，结果如下表 5 所示。实际平均密粘褶菌抑制率值为 66. 13%，比预测值低1. 79%，相对标准偏差(RSD)值为1. 38%。当乙醇浓度为 95%，液料比为 20∶1，超声时间为 59. 00 min，超声温度为 65. 0℃，预测彩绒革盖菌生长抑制率达到最大值为 20. 59%，预测密粘褶菌生长抑制率达到最大值为 64. 61%，按照此工艺条件进行 3 次平行验证试验。实际平均彩绒革盖菌生长抑制率达为 21. 39%，比预测值高0. 80%，相对标准偏差(RSD)值为1. 82%，实际平均密粘褶菌生长抑制率为 63. 54%，比预测值低1. 07%，相对标准偏差(RSD)值为0. 88%。试验结果表明，该响应曲面数学模型具有良好的预测性。
3 结论
关于川椒的最优提取工艺已有较多的文献报道，但文献多以川椒提取率为指标对其提取工艺进行优化，本试验以乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度为因素，对 2 种常见的木材腐朽菌的抑制率为指标，确定了川椒的最优提取工艺：当乙醇浓度为 95%，液料比为 12∶1，超声时间为 40. 00 min，超声温度为 45. 0℃，此时彩绒革盖菌生长抑制率达到最大值，此时彩绒革盖菌生长抑制率为 26. 35%;当乙醇浓度为95%，液料比为20∶1，超声时间为53. 00min，超声温度为 65℃，此时密粘褶菌生长抑制率达到最大值，此时密粘褶菌生长抑制率为 66. 13%，;当乙醇浓度为 95%，液料比为 20∶1，超声时间为59. 00 min，超声温度为 65. 0℃，此时彩绒革盖菌生长抑制率和密粘褶菌生长抑制率达到最大值，实际平均彩绒革盖菌生长抑制率为 21. 39%，相对标准偏差(RSD)为 1. 82%，实际平均密粘褶菌生长抑制率为63. 54%。川椒的醇提物对2种常见的木材腐朽菌均具有一定的抑菌性能。试验为川椒的多效开发利用提供了参考，也为植物源木材防腐剂提供了新思路，具有一定的实际应用前景。
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作者：盛婧源，王长健，王雅梅*，任士明，赵晓琪
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