超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦粉及面粉中次磷酸盐

　　摘要：采用高分辨质谱仪(TOF-MS/MS)及超高效液相色谱-串联质谱仪建立了小麦粉及面粉中次磷酸盐的定性及定量的检测方法。样品经水提取后，加入甲醇萃取净化方法，提取液离心，直接过滤后，进样测定，WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色谱柱进行分离，乙腈：65mmol/L甲酸铵水溶液=70∶30为流动相等度洗脱，电喷雾负离子多反应监测扫描(MRM)模式下进行测定，外标法定量。次磷酸盐的线性范围0.02～2.00μg/mL，相关系数(r2)0.9910～0.9993之间，定量限为0.2mg/kg，于1倍定量限(0.2mg/kg)、2倍定量限(0.4mg/kg)、10倍定量限(2mg/kg)3个添加水平下进行加标回收试验，次磷酸盐平均回收率在79.60%～98.55%之间，相对偏差在1.62%～4.00%之间。结论：该方法操作方便、简单、快捷、清洁、灵敏度高、重复性好，解决了次磷酸盐在食品中无相关液相质谱检测方法的问题，可为小麦粉及面粉中次磷酸盐的检测提供更方便、更快捷的检测方法支持。

　　关键词：超高效液相色谱-串联质谱;高分辨质谱仪(TOF-MS/MS);次磷酸盐;方法支持

　　次磷酸盐有次磷酸钠、次磷酸钙、次磷酸铵、次磷酸镍、次磷酸钴、次磷酸铁等。其中次磷酸钠、次磷酸钙、次磷酸铵使用较多[1]。次磷酸钠是一种理想的还原剂，主要用于化学镀、电镀、有机合成工业，也可用于食品添加剂和动物营养剂、制造医药品[2]。目前，次磷酸盐主要应用于工业生产，国内外研究主要集中于次磷酸盐的生产监测[3-4]。我国是世界上最大的小麦生产国，面粉是面制品加工最重要原料，其质量的好坏直接影响到面制品的质量。我国关于食品添加剂的安全卫生标准GB2760-2014，该标准提出了可用于食品生产的添加剂，并规定限量。

　　次磷酸钠等次磷酸盐并未列入该标准中，市场上销售的次磷酸盐主要以次磷酸钠和次磷酸钙为主，我国国家食品药品监督管理局关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告(2017年第132号)中提出严禁生产企业在小麦粉中添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫脲、间苯二酚、过硫酸盐、噻二唑、曲酸等非食品原料。然而我国目前还没有食品中次磷酸盐快速测定的方法，次磷酸钠的分析测定方法只有离子交换色谱法，这些方法耗时长，不利于快速测定，也不能满足小麦粉及面粉质量的监测。超高效液相色谱-串联质谱法，操作简便，常用于非法添加的化合物测定。因此开发出小麦粉及面粉中次磷酸盐的含量的测定方法，可为监管部门监管面粉生产和加工生产提供技术支撑。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　次磷酸钠标准品：采用具有证书的标准品或高纯试剂，纯度>99%，英文名称：Sodiumhypophosphitemonohydrate;CAS号：10039-56-2;分子式：H2NaO2P·H2O，相对分子量：105.99;乙腈(CH3CN)、甲醇(CH3OH)均为色谱级，购自美国Fisher公司;甲酸铵(HCOONH4)为色谱级，购自麦克林公司;微孔滤膜：0.22µm，有机系;水为GB/T6682中规定的水。

　　1.2仪器与设备

　　ABSciex4500超高效液相色谱-串联质谱仪(美国应用生物公司);Talboys涡旋仪;Elma超声仪;Milli-Q超纯水仪;XS204电子天平(感量0.0001g，梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司);ME2002E电子天平(感量0.01g梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司);AllegraX-15R离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1标准溶液的配制

　　标准储备液：准确称取标准品，折算成H2PO2-20.0mg(精确至0.0001g)，置于10mL容量瓶中，用水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为2mg/mL标准储备液，4℃保存，有效期1个月。标准中间液：准确移取100μL标准储备液(1.3.1)，置于100mL容量瓶中，用水溶稀释至刻度，摇匀，制成浓度为2μg/mL的标准中间液，4℃保存，有效期1个月。标准工作液：准确吸取标准中间液适量，用水稀释，系列标准工作液浓度依次为：0.00μg/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL，现配现用。

　　1.3.2样品前处理

　　准确称取1g(精确至0.01g)试样，置于10mL容量瓶中，准确加入3mL水，涡旋1min后超声15min，取出，放至室温，用甲醇定容至刻度，涡旋1min后超声15min，取出，放至室温，用甲醇补足至刻度，提取液转移至15mL聚四氟乙烯离心管中，于离心机上以4000r/min的速率离心5min，取上清液，经0.22µm滤膜过滤后供高效液相色谱-串联质谱测定。

　　1.3.3色谱条件

　　1.3.3.1液相色谱条件

　　a)色谱柱：WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色谱柱;b)流动相：乙腈：65mmol/L甲酸铵水溶液=70∶30;c)流速：0.7mL/min;d)柱温：35℃;e)进样量：5μL。1.3.3.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源(ESI源);b)检测方式：多反应监测(MRM);c)扫描方式：负离子模式;d)电喷雾电压：-4500V;e)离子源温度：600℃;f)监测离子对和定量离子对为64.9/62.9;去簇电压(DP)：-80V、碰撞能量(CE)：-30V。

　　2结果与分析

　　2.1提取溶液的选择

　　次磷酸钠是一种无机盐，极易溶于水，在参考氯酸盐和高氯酸盐测定补充检验方法及其它文献中提取溶剂的基础上，本研究比较考察了①水∶甲醇=3∶7;②水∶乙腈=3∶7;③水∶甲醇=3∶7(含1%甲酸);④水∶无水乙醇=3∶7;⑤纯水;⑥水∶甲醇=9∶1;⑦水∶甲醇=7∶3;⑧水∶甲醇=5∶5;⑨纯甲醇，9种提取溶液，以次磷酸盐加标回收率为指标，选择最佳提取液。

　　其中水和甲醇的比例与水和乙腈的比例相同情况下提取时，次磷酸盐的回收率相差不大，但甲醇相对比较经济且毒性低，最后选择有机相为甲醇;水∶无水乙醇=3∶7条件下提取时，次磷酸盐的回收率偏高，超过130%，可能无水乙醇溶解性较强，提取了更多的杂质，基质增强，使得回收率偏高;随着提取液中有机相(甲醇)的比例提高，次磷酸盐的回收率变化无规律，虽然用纯水提取时回收率在85%左右，但提取时，提取液高速离心后仍较浑浊，不易过滤膜，最后舍弃;最后确定最佳提取液比例为水∶甲醇=3∶7。

　　2.2提取方式的选择

　　在提取时，也比较了2种提取方式，方式一：先加入3mL水超声15min后再加入7mL甲醇，再超声15min，混匀，离心;方式二：直接加入混合好的水∶甲醇=3∶7溶液，超声15min提取，混匀，离心。同样以次磷酸盐的回收率为考察指标，结果表明在提取液最后甲醇含量相同的条件下，分开加入水和甲醇和直接加入混合好的溶液提取，目标化合物的回收率方式一比方式二高，这可能是由于次磷酸盐在水中的溶解性比甲醇中好。因此，确定先加入3mL水超声提取，再加入7mL甲醇超声，混匀，离心。

　　2.3样品净化方式的选择

　　参照文献中一些无机盐的检测，样品前处理多采用固相萃取技术进行净化。次磷酸盐极易溶于水且及性较强，而小麦粉中含有一些其他的非极性的杂质，只能通过萃取柱吸附杂质的方式来净化样品，最后选择C18萃取柱、氧化铝萃取柱、PRIMEHLB萃取柱进行考察。由于提取溶液中有机相比例较高，当上样液上完后，无需淋洗步骤，直接弃去流出液约1mL，续滤液直接过有机膜上机测定。

　　以目标化合物的回收率为指标，结果表明，样品经过三种萃取柱净化后目标化合物的回收率与未经萃取柱净化直接过膜上机的净化方式的回收率相差不大，均在90%左右。后考虑到固相萃取小柱成本较高，操作过程繁琐，对于某些提取液较浑浊的样品，过柱速度慢，且易发生小柱堵塞的现象，从而影响回收率以及方法的重现性，本文采用提取溶液对样品直接提取。

　　2.4色谱条件的优化

　　2.4.1色谱柱的选择

　　次磷酸盐是一种含有强阴离子次磷酸根(H2P02-)的盐类，常规高效液相色谱柱不适用于分析次磷酸根离子，需选择特殊的阴离子交换色谱柱。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)柱是由阴离子交换填料组成，提供高分离度，高灵敏度的阴离子分析。因此选择专一性较强的WatersIC-PakTMAnionHR色谱柱来进行分析实验。

　　2.4.2流动相的选择

　　根据次磷酸盐的化学性质，及WatersICPakTMAnionHR色谱柱的特性，在分析实验时，需要在流动相中加入挥发性盐，才能保证次磷酸盐有良好的峰形和适当的保留时间。因此考虑了两种常用的挥发性盐甲酸铵和乙酸铵，分别考察了20mmol/L的甲酸铵水溶液、65mmol/L的甲酸铵水溶液、100mmol/L的甲酸铵水溶液;20mmol/L的乙酸铵水溶液、65mmol/L的乙酸铵水溶液、100mmol/L的乙酸铵水溶液，甲酸铵和乙酸铵在浓度相同及流动相比例相同的情况下，次磷酸盐出峰时间及色谱峰形无明显差别，而根据本实验室实际情况，甲酸铵比较常用于质谱，最后选择甲酸铵。

　　随着甲酸铵浓度的增加，次磷酸盐的保留时间会提前并且峰形会变窄更易积分，但当甲酸铵为100mmol/L，盐浓度较高，且流动相中乙腈的比例也较高，在大量分析样品时，盐容易在色谱柱上析出，堵住色谱柱，使用不当，甚至堵住质谱，因此，处于安全及延长色谱柱寿命，最后选择甲酸铵浓度为65mmol/L。WatersIC-PakTMAnionHR(4.6×75mm)色谱柱粒径为6μm，需要高流速才能提高柱效，流速过高，出峰时间过早，且色谱柱压较高，同时质谱部分允许最大流速为1mL/min，高流速需要更高的雾化气和更高的雾化温度，最后通过实验，0.7mL/min，满足分析要求，因此最后确定流速为0.7mL/min。

　　3结论

　　加强小麦粉及面粉中次磷酸盐的非法添加的风险监测，对保障食品安全，促进国民健康及社会经济发展都具有重大意义。目前，虽然国内对小麦粉中次磷酸盐的添加情况进行了明确的规定：严禁小麦粉中添加次磷酸盐等非食用物质，但缺少及相关技术方法支撑。本方法采用超高效液相色谱-串联质谱法测定小麦粉中的次磷酸盐。选择直接提取处理步骤，使得实验操作更加绿色环保、简便快捷。通过优化液相及质谱条件，建立了快速、高效检测小麦粉中次磷酸盐的方法，该方法操作方便、简单、快捷、清洁、灵敏度高、重复性好，可在大多数分析实验室推广应用，同时，也为食品安全监管提供了有利的技术支撑。

　　参考文献：

　　[1]周海，廖艳芳，莫友彬.次磷酸钠及其相关物质的离子色谱分析[J].化工技术与开发，2018，47(9)：46-47.

　　[2]钟本和，王辛龙，张志业，欧庆祝.次磷酸盐和亚磷酸盐介绍[J].无机盐工业，2015，47(9)：1-4.

　　[3]袁宇，苏子奇，李宇涵，普会文，胡红.次亚磷酸盐还原—碘量法测砷方法的改进[J].农村实用技术，2017(1)：51-52.

　　化工论文投稿刊物：《化工技术与开发》(月刊)创刊于1972年，由广西化工研究院主办。是面向石油化工行业科技、技术工作者的省级技术刊物。旨在推广石油化工行业生产新技术、科技新理念，交流生产新经验，为广大科研工作者和一线生产人员提供技术交流平台，推动石油化工行业技术进步。

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