巯基-烯点击反应介导的生物传感研究进展

　　摘要：巯基-烯点击反应是一种无金属催化的点击反应，目前正广泛应用于分子标记、新材料合成和材料表面功能化等方面。详细介绍了巯基-烯点击反应的反应机理、影响反应的因素，以及该反应介导的生物标记技术。在此基础上，论述了巯基-烯点击反应在生物传感、细胞成像、纳米材料的生物功能化方面的应用。最后预测了巯基-烯点击反应在未来的发展方向和应用前景。

　　关键词：巯基-烯点击反应;生物传感;细胞成像;功能化

　　点击化学反应是通过碳-杂原子键的连接快速合成有用的新化合物的反应，由化学家Sharpless、Kolb及Finn于2001年提出后受到越来越多的关注[1]。点击化学有以下一种或多种特征：反应快速;通量合成高;操作简单;反应条件温和;原料来源广;反应产物易纯化，产物得率高[1]。

　　点击反应的有多种，包括环加成反应，亲核开环反应，非醇醛的羰基化反应，碳-碳多重键加成反应，叠氮-膦偶合反应。狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alderreaction)和1，3-偶极-环加成反应(copper-catalyzedazide-alkynecycloaddition，CuAAC)属于环加成反应;氮丙啶、环氧化物和环状硫酸酯等发生的反应属于亲核开环反应;腙、肟醚和芳香族杂环的形成属于非醇醛的羰基化反应;二羟基化反应和环氧化反应属于碳-碳多重键加成反应;施陶丁格连接属于叠氮-膦的偶合反应。按照是否需要金属作为反应催化剂可以将点击反应分为金属催化的点击反应和无金属催化的点击反应。如CuAAC为金属催化的点击反应，而叠氮-炔环加成反应(strain-promotedalkyne-azide cycloadditions，SPAAC)和巯基-烯点(thiol-ene)击反应则为无金属催化的点击反应。

　　金属催化的点击反应在生物学领域的使用具有一定的限制性，因金属离子难以被纯化分离，而且具有潜在的生物毒性作用，可能会损害机体健康。因此，无金属催化的点击化学反应如狄尔斯-阿尔德反应、施陶丁格连接和巯基-烯点击反应受到了广泛的关注。在材料合成和生物分子标记中，巯基-烯点击反应都发挥着重要的作用。巯基-烯点击反应被广泛的应用于生物大分子的合成如树枝状化合物的合成和聚合物的合成等方面。巯基-烯点击反应还可以应用于蛋白质、核酸链和聚糖等生物分子的标记中。

　　另外，巯基-烯点击反应在材料表面功能化方面也具有很重要的作用。在生物传感方面，巯基-烯点击反应具有非常具有广阔的应用前景。本文对巯基烯点击反应进行了综述，详细介绍了巯基-烯点击反应的反应机理、影响反应速率的因素和生物大分子的标记。并且介绍了巯基-烯点击反应介导的生物传感器及与生物传感相关的应用，包括生物功能化纳米材料和细胞成像等方面。最后对巯基-烯点击反应在生物传感领域的发展进行了展望。

　　1巯基-烯点击反应偶联机理及性质

　　硫醇-烯点击反应通常包括自由基介导的巯基-烯点击反应和亲核试剂催化的巯基-迈克尔加成反应。自由基引发的巯基-烯反应机理可以分为以下几个步骤：首先，在加热或光照的条件下，引发剂吸收能量被激发裂解，形成自由基;接着，形成的自由基和巯基发生反应，夺取巯基上的氢原子，触发巯基自由基形成;然后，形成的巯基自由基和烯基发生反应，形成烷基自由基;之后，烷基自由基会进攻巯基化合物，夺取巯基上的氢原子，引发链增长，同时产生新的巯基自由基。这些新产生的巯基自由基可继续和烯基反应。其中第二步产生的巯基自由基可引发链增长也可以发生双基终止[2]。

　　亲核试剂催化的巯基-迈克尔加成反应的反应机理包括以下步骤：硫醇与亲核试剂的反应促使巯基去质子化，成为相应的硫酸盐阴离子。硫酸盐是一种很强的亲核体，与活化的C=C加成，形成中心碳为阴离子的中间体。之后这个中间体吸收一个质子，形成巯基-烯产物[3]。近几年，巯基-烯反应点击化学的特性受到了人们的广泛关注，在生物应用领域也已经扩展到交联网络、生物传感以及功能化生物材料等方面。从合成的角度看，巯基-烯的反应有十分显著的优势，如反应速度快，应用范围广(不管反应物活性如何，大多数的烯烃和所有的巯基几乎都能满足反应条件)，基本上属于最简便的一种无金属催化的点击化学反应。

　　2巯基-烯点击反应的影响因素

　　2.1巯基结构对反应速率的影响

　　参与巯基-烯点击反应的巯基化合物主要有4种，包括烷基硫醇酯类、烷基(芳基)硫醇类、烷基3-巯基酯类硫醇和烷基硫醇。在巯基-烯点击化学反应中，反应速率和巯基化合物的结构有关。含有推电子基团的巯基化合物的反应活性较高，如异丙撑基;含有吸电子基团的巯基化合物反应活性较低，如酯基。巯基-烯点击反应的巯基化合物的反应活性由小到大分别为硫苯酚类、烷基硫醇酯、烷基3-巯基酯类硫醇和烷基硫醇。

　　2.2烯类单体结构对反应速率的影响

　　缺电子烯和富电子烯与巯基的反应是巯基-烯点击化学反应的主要两种类型。巯基与富电子烯之间反应迅速，如降冰片烯与巯基的反应速率很快。巯基与缺电子烯之间反应较慢，如马来酰亚胺、丙烯酸酯等。这是由于缺电子烯的双键需要被激活，所以需要弱碱性的催化剂催化才能进行，如三乙胺等亲核试剂。一般而言，巯基-烯点击反应的反应速率随着烯类单体碳碳双键电荷密度的下降而下降。

　　3巯基-烯反应介导的生物标记技术

　　目前，巯基-烯点击反应已经应用于反应物官能化和聚合反应中，并且在生物分子的官能化方面已经有良好的应用。巯基-烯点击反应满足生物材料所要求的选择性、易于实施和高产率的特点，因此可以应用于生物材料的标记以实现生物分子功能化。虽然热敏自由基引发剂如偶氮二异丁腈已经被应用于在生物材料的功能化领域，但是在大规模合成时，受反应器设计和光衰减等因素的限制，升高 反应温度才能更好的实现生物材料本体自由基均匀生成[6]。而巯基-烯点击反应在不需要升高温度的条件下，也可以容易地实现生物材料本体自由基均匀化和官能化。

　　4巯基-烯点击反应在生物传感中的应用

　　随着巯基-烯反应应用范围的不断拓宽以及生物传感器在检测中的快速发展，巯基-烯反应介导的生物传感器逐渐增多，如荧光生物传感器、细胞传感器、电化学传感器等。可以实现miRNA、DNA、含有巯基的生物活性物质、整合素αvβ3过表达细胞、哺乳动物细胞、葡萄糖氧化酶、乳糖酶和凝集素等的检测。

　　5巯基-烯点击反应在细胞成像中的应用

　　生物成像可以用于详细了解细胞过程和疾病机制。巯基-烯点击反应作为无金属参与的点击反应，在反应动力学、反应物毒性以及生物利用度等属性上都十分适用于生物分子在细胞及体内的成像，有助于人们更好地了解生物分子参与的生物过程以及在生物体系中的发挥的作用。细胞成像一般需要发生肽或蛋白质特异性反应，才能实现细胞的图案化。利用巯基-烯点击反应可以将烯基官能化(烯丙基和降冰片烯残基)防污聚合物刷与细胞黏附附肽RGD和精氨酸谷氨酸天冬氨酸缬氨酸偶联后，可以观察聚合物刷对脐静脉内皮细胞的黏附作用。

　　另外，为了实现良好的细胞成像功能，可以在聚合物刷子的表面连接上光致发光肽，通过荧光显微镜和原子力显微镜能够观察到细胞微阵列[36]。含有烯基的四苯乙烯-马来酰亚胺加合物是一种巯基特异性生物探针。当这种生物探针暴露于含有巯基的L-半胱氨酸时，通过巯基-烯点击化学反应，可以产生易于观察的荧光。

　　因此可以利用四苯乙烯-马来酰亚胺加合物作为可视化试剂对活细胞进行标记，得到清晰的荧光图像。这为描绘细胞中含有巯基的化合物的分布提供了一个简便、特异、灵敏的荧光标记方法[28]。利用硫醇-烯点击化学反应可以将含有巯基的聚乙二醇有效地引入非荧光纳米金刚石中，得到聚乙二醇化的荧光纳米金刚石。这种复合材料显示出高的水分散性、强的荧光性和低的细胞毒性，并具有良好的细胞染色性能，在生物成像方面显示出巨大潜力[37]。

　　6巯基-烯点击反应在纳米材料的生物功能化中的应用

　　随着新型材料的特性不断被发掘，纳米材料作为其中一员，因其结构庞大，负载能力高以及独特且可调控的物理和化学性质成为药物递送系统开发中的重要工具。巯基-烯点击反应介导的纳米材料药物递送技术也得到一定程度的发展。巯基烯点击化学反应可以将具有巯基的各种化合物缀合到烯基官能化的硅纳米颗粒的表面，而不影响硅纳米颗粒的特征荧光性质[38]。硫醇-烯烃点击化学反应可以在大气环境下功能化硅表面而不引入氧化硅，否则会对电子性能产生不利影响。有的研究学者在非常温和的条件下利用巯基-烯点击化学的方法将各种功能分子连接到无氧化物的Si(111)表面上，而不引入氧化硅。这种方法具有通用、有效、简便的和可模式化等特点，为生物功能电子学提供了新的途径[39]。

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　　7展望

　　巯基-烯点击化学反应因其简便性受到了科研工作者的青睐。巯基-烯点击反应的操作性强，产率和转化率高，反应速度快等优势，使其在聚合物科学和分子合成方面具有很大的潜力。目前巯基-烯点击反应在生物传感领域的应用仍有一些不足之处：(1)目前合成含有双键的单体或聚合物的方法已经比较成熟，且得到的化合物种类丰富。而含有巯基的化合物的合成过程复杂，并且巯基化合物结构种类不足。这不利于了巯基-烯点击化学反应在生物传感领域扩大应用范围。因此，探索合成不同种类和官能度的巯基化合物是之后的研究重点之一。(2)对生物分子不同位置进行官能团标记的成本较高也限制了巯基-烯点击反应在生物传感领域的广泛应用。(3)目前巯基-烯点击化学反应主要集中于检测小分子和核酸的荧光传感器，导致传感器的种类缺乏多样性。因此，将巯基-烯点击化学反应更多的应用于其他类型生物传感器是值得研究的方向，如光谱生物传感器、可视显色传感器、仿生传感器等。这将有助于拓宽巯基-烯点击反应的应用范围。

　　参考文献：

　　[1]KolbHC,FinnMG,SharplessKB.Clickchemistry：diversechemicalfunctionfromafewgoodreactions[J].AngewChemIntEdEngl,2001,40(11)：2004-2021.

　　[2]NweK,BrechbielMW.Growingapplicationsof“clickchemistry”forbioconjugationincontemporarybiomedicalresearch[J].CancerBiotherRadiopharm,2009,24(3)：289-302.

　　[3]LoweAB.Thiol-ene“click”reactionsandrecentapplicationsinpolymerandmaterialssynthesis[J].PolymChem,2010,1(1)：17-36.

　　作者：郑淑娟1 仝涛1，2 许文涛1，2，3 黄昆仑1，2，3

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