瓜菜花粉细胞学观察及活力测定概述

　　摘 要： 植物的生长发育从花粉发育开始，对植物花粉细胞学的观察与活力测定是研究雄配子发育的工作基础。花粉的生长发育关系到瓜菜类作物自身的生活发育，花粉的活力为花粉发育、植株受精提供了保障，花粉细胞学观察为更好利用掌握花粉发育过程进而研究花调控的分子机制做准备。但影响花粉整个生长发育阶段的因素有很多，为准确地判断花粉活力以及花粉发育关系到植株育性、花芽分化、结实率、光周期等，进一步影响到分子育种及农业经济效益，因此对花粉进行活力测定与细胞学观察必不可少。笔者对葫芦科植物花粉细胞学以及活力测定方法进行了综述，重点介绍了花粉细胞学以及活力测定的方法，对各种相应的方法在蔬菜中的应用进行了总结，并对观察测定的应用进行了一定程度的展望。所介绍的观察测定方法为更好地选出适合判断西瓜、甜瓜、黄瓜等花粉活力及细胞学观察的方法提供了一定的参考，以便于开展授粉育种工作。

　　关键词： 瓜菜作物; 花粉细胞学观察; 花粉活力测定

　　現所知的植物种类近30万种，开花植物比例较大，占据90%以上，其中我国栽培的蔬菜包括20多个科，其中葫芦科为8大科之一，包括苦瓜、冬瓜、丝瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦等，在中国蔬菜生产中占有重要到地位[1]。根据中国农业统计资料显示，全国2015年蔬菜总产量比粮食总产量高1.64亿t，占农作物播种面积1/10，创造了占种植业近1/3的产值。在蔬菜作物中瓜菜类作物种植面积也在随之增长，其中西瓜的种植面积就占到73%[2]。瓜菜中花作为整个生活史中重要的器官，承载着信息遗传，但具有一定的遗传保守性，对花发育过程的研究关系到植物的生殖过程，进一步关系到植物的经济效益。从花粉的综合性状、大小、萌发孔样式以及外部纹络来进行比较，存在着巨大的差异性，种间差异要大于品种、类型间差异。花粉的发育伴随着花的外部形态的改变，随着开花时间环境的不同，花粉的发育状态以及活力情况也不相同。对花粉细胞学观察及活力测定一方面能更好地掌握花的发育过程，另一方面为更好利用花的调控机制为育种奠定基础和判断作用。当前，对花粉的细胞学观察及花粉活力的测定虽说在不断地进步，在花粉细胞学观察方法方面，主要包括切片法、压片法、电镜检测等方法，以及对花粉活力测定的直接授粉法、染色法、离体培养法等均在不同的作物中进行应用验证，但对细胞学观察以及花粉活力测定在瓜菜中的运用方法并没有系统性地进行总结对比，在各类瓜菜中根据不同的种类观察方法效果也不尽相同。笔者通过对瓜菜中已经运用的观察测定方法进行了概述，以找到适合西瓜花粉细胞学观察与活力测定的方法并加以运用。

　　1 有花植物花粉发育及观察

　　在高等植物中花粉大致可分为二细胞型和三细胞型2类，花粉的发育可分为3个阶段，从小孢子发生期到雄配子体形成期到花粉成熟期，其中小孢子发生期即造孢细胞的分化和减数分裂过程，雄配子体形成期即自由小孢子减数分裂后的发育这一系列的过程是细胞学研究的重点，主要涉及到的具体发育过程大致如下：花药发育初期，未分化的孢原细胞进行平周分裂为外层的周缘细胞和内层的造孢细胞。继而周缘细胞分裂形成药室内壁、中层及绒毡层，与花药表皮共同构成花粉囊壁包围造孢细胞及其衍生细胞。另一方面，在周缘细胞分裂的同时，初生造孢细胞经多次有丝分裂产生花粉母细胞，再经减数分裂形成四分体。在花粉发育过程中，绒毡层逐渐向外分泌胼胝质酶，分解胼胝质，使未成熟的4个小孢子互相分离，慢慢形成小孢子，然后小孢子进行第一次不对称有丝分裂，产生细胞核-营养核和生殖核。小孢子发育到一定阶段，生殖细胞逐渐进入营养的细胞质中，形成成熟花粉粒[3]。在花粉成熟之后伴随着外界环境以及自身的生长发育，花粉的活力也随之变化，对花粉细胞发育以及活力测定的研究可更好地为生产与育种做准备。这些过程相对独立但彼此又紧密联系，并受众多基因的调控。对花粉发育时期的观察结合细胞学、转录组学、代谢学为进一步探究花调控相关机制奠定基础。

　　随着科研技术的提高，对花粉发育时期的划分也更加详细。对花粉发育时期的划分方法也在不断的完善。针对不同作物，花粉发育时期以及活力情况也不相同。在1921年Belling提出植物染色体压片技术后，压片观察已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术。Sanders等[4]根据拟南芥花药发育过程中发生的主要代谢物将花药发育分14个时期。在对拟南芥的花粉结构观察分析中将花粉发育时期划分为15个时期，并对发育过程中花粉母细胞至成熟花粉粒进行了特别关注[5]。随后在水稻中Jun-Ichi Itoh将花药的发育时期划分为8个时期，主要分为两大类——花药孢子体发育时期、雄配子体发育时期[6]。在烟草中根据代谢途径将配子体发育划分为8个时期，并进行了相关代谢通路验证[7]。近年来，人们对花粉发育基本过程的认识有了很大的提高，其中许多信息来自于对雄性不育突变体的详细研究，主要包括拟南芥[8-9]、油菜[10]、棉花[11]、大白菜[12]等植物。

　　另一方面，花粉活力的测定方法根据每种作物的不同习性来选择，现有的测定方法主要包括花粉人工培养法、染色法、授粉法[13]。1982年对小麦的花粉采用TTC染色法进行了活力测定以判断花粉败育及生理突变情况[14]。随后在检测甜椒贮藏花粉活力比较中采用荧光镜检新鲜花粉和红四氮唑染色镜检贮藏花粉得到了不同温度下花粉活力的变化情况[15]。胡适宜[16]对测定花粉生活力的经典方法——离体萌发测定的方法及步骤进行了详细的介绍总结。除此之外，1994年在烟草中采用了TTC法、联苯胺-α萘酚染色法、I-KI染色法3种方法对烟草花粉活力进行测定，并与发芽率进行了结合，系统地比较了3种染色法结果的差异性。整体来说I-KI染色法的差异性较大。但在染色方法上明显已经有了进一步的探究[17]。随着生物技术的进步，在Randolph首次发现单倍体后，人们开始对单倍体进行研究，在这个过程中涉及到花药、花粉的培养，确保培养的前提在于花粉具有一定的活性，2001在大田作物玉米中为进行单倍体育种采用Sangduen N等[18]的0.5%稀醋酸洋红染色方法进行判断，以染色为全红的花粉粒判定为活性花粉用于单倍体加倍鉴定以获得纯合二倍体。随后王钦丽等[19]分别比较了胡适宜的TTC测定法、p-苯二胺测定法的优缺点。在模式植物拟南芥的花粉研究应用中除了采用常用的TTC染色法之外，还用到了较为简便的Aexander染色法，其判断花粉活力主要根据染液中的孔雀石绿对细胞壁的着色和酸性品红与花粉原生质着色深浅情况[20]。除了普通的染液染色观察，荧光染色显微观察技术也在不断发展应用，对活力的测定运用最多的是荧光素二醋酸酯(FDA)，在洋葱、番茄等已成功多次运用。花粉活力的测定方法经常多种方法相互结合对比使用，以判断出最适宜某种植物的方法。通过概述现已有的花粉活力的测定方法，对测定西瓜花粉活力的方法应用有一定借鉴意义，对西瓜生产、选育等方面有一定的辅助作用。

　　2 瓜类作物花粉细胞发育及活力测定

　　在植物花的发育阶段中可分为3个阶段：成花诱导、形成花原基、花器官的形成及其发育。这3个发育阶段按照花发育的分子生物学模型包含ABC模型、ABCDE模型。在最初的ABC模型中3个功能区域控制相关组织的产生，A类基因单独控制萼片发育，A类和B类基因共同调控花瓣发育，B类和C类基因控制雄蕊的发育，C类基因单独控制心皮的发育。之后在矮牵牛、拟南芥中发现了D功能基因控制胚珠发育，而E功能基因并不直接转换花器官，而是一类特殊基因参与。基因控制花器官形成过程中包含细胞的分化，在花芽分化的過程中，分化顺序为花原基、萼片、花瓣、雌蕊原基、雄蕊原基5个时期[21]。在成花诱导的过程中与光照和温度等因素密切相关，在外界环境合适的情况下伴随着减数分裂、有丝分裂而发育。在花粉的形成发育过程中，从孢原细胞分化形成造孢细胞经有丝分裂形成花粉母细胞，经减数分裂形成四分体，四分体分离形成单核花粉，每个单核花粉发育伴随着细胞核的运动，划分为单核早期、单核中期、单核靠边期，细胞核经有丝分裂形成双核(营养细胞核、生殖细胞核)最后发育形成成熟花粉粒。

　　2.1 瓜类作物花粉的细胞发育过程

　　在葫芦科作物花粉发育过程中细胞发育与其表观性状紧密相连。其花粉发育途径为：小孢子母细胞-四分体时期-单核早期-单核中期-单核靠边期-双核早期-双核中期-双核晚期-三核期-成熟花粉时期。在花粉由花粉母细胞减数分裂，胼胝质包围4个小孢子形成四分体，在不同时期下小孢子形状也不相同。四分体从胼胝质壁破裂释放出外形不规则的小孢子，之后很快变成圆形或近圆形的单核花粉粒，随着单核花粉粒的发育进行有丝分裂形成1个营养细胞和1个生殖细胞的双核花粉粒，双核花粉粒发育到一定阶段，生殖细胞进入营养细胞质中形成成熟花粉粒。在对花粉发育时期的研究中多采用细胞镜检的方式进行观察研究，同时与植物外部形态进行联系。

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