本文摘要：摘要采用超声辅助法提取黄花草总黄酮，通过单因素试验和正交试验确定了总黄酮的最佳提取工艺条件，并研究了黄花草总黄酮对羟基自由基(OH)、DPPH自由基(DPPH)和亚硝酸盐的清除效果。结果表明：黄花草总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1∶15(g/mL)，乙醇浓度50
摘要采用超声辅助法提取黄花草总黄酮，通过单因素试验和正交试验确定了总黄酮的最佳提取工艺条件，并研究了黄花草总黄酮对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)和亚硝酸盐的清除效果。结果表明：黄花草总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1∶15(g/mL)，乙醇浓度50%，提取功率40W，超声时间50min，提取温度50℃，该条件下黄花草总黄酮得率为(2.711±0.002)%。黄花草总黄酮对·OH和亚硝酸盐具有明显清除能力，对DPPH·具有较强清除能力，最大清除率分别为(52.48±0.88)%，(95.58±0.28)%，(57.27±0.15)%，表明黄花草中的总黄酮具有较好的抗氧化能力。
关键词黄花草;总黄酮;超声辅助;提取工艺;抗氧化活性
黄花草是山柑科药用植物，主要分布在热带及亚热带地区，在中国云南、广西和福建等地都有种植[1]，其种子可入药、榨油，鲜叶可用于治疗眼病[2]。目前有关黄花草的研究主要集中于药用价值及重金属胁迫下种子萌发等方面，如Parimaladevi等[3]研究了黄花草提取物对老鼠的止痛作用机制，周鑫磊[4]研究了Mn2+对黄花草种子萌发、幼苗生长等的影响及胁迫生理生化特征的变化，而关于黄花草有效成分及抗氧化方面的研究鲜见报道。黄酮类成分是普遍存在于植物体中的一种天然抗氧化剂，具有抗氧化[5]、抑菌[6-7]和抗病毒[8]等药理作用。目前提取植物体中总黄酮的常见方法有溶剂浸提法、酶辅助提取法和超声辅助提取法等，其中超声辅助提取法因具有简单、安全、高效等优点而备受关注[9]。试验拟以黄花草为原料，采用超声辅助法提取黄花草中的总黄酮，优化其提取工艺条件，并研究黄花草总黄酮对·OH、DPPH·和亚硝酸盐的清除能力，以期为黄花草的研究及开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1材料与试剂
黄花草：摘自广西崇左市江州区市政府公园，经广西民族师范学院黄秋蝉教授鉴定为山柑科植物黄花草(CleomeviscosaL.);芦丁标准品：生化试剂，上海晶纯试剂有限公司;无水对氨基苯磺酸：分析纯，天津市光复精细化工研究;盐酸萘乙二胺：分析纯，国药集团化学试剂有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：≥97.0%，阿拉丁公司;氢氧化钠：分析纯，广东光华科技股份有限公司;95%乙醇、30%过氧化氢、亚硝酸钠、硝酸铝、水杨酸、七水合硫酸亚铁等：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
1.1.2主要仪器设备
高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平：JA1003N，上海精密科学仪器有限公司;循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司;可见分光光度计：7200型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;超声波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超声仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1黄花草的预处理工艺流程
黄花草洗净→电热鼓风干燥箱烘干(60℃)→粉碎→过筛(60目)→脱脂脱色(石油醚中浸泡、搅拌)→抽滤→烘箱干燥(50℃)→避光保存备用
1.2.2黄花草总黄酮的提取取1.0000g黄花草粉末，加入一定量乙醇溶液，充分混匀，设定提取功率，在一定温度下超声提取至指定时间，过滤，将滤液定容至50mL容量瓶中，摇匀备用。
1.2.3芦丁标准曲线的绘制根据文献[10]，修改如下：先用70%(体积分数，下同)乙醇溶液配制0.2mg/mL的芦丁标准溶液，再准确吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0mL0.2mg/mL芦丁标准溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，摇匀备用。吸取1.0mL标准溶液于10mL的比色管中，加入0.3mL5%的亚硝酸钠溶液摇匀，静置6min;随后加入0.3mL10%的硝酸铝溶液，摇匀，静置6min;再加入4.0mL4%氢氧化钠溶液，然后用70%乙醇溶液定容至10mL，摇匀后放置反应15min，以70%乙醇溶液作为空白，于510nm处测定溶液吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为：A=10.882x-0.0002，R²=0.9997，说明在此浓度范围内，吸光度与芦丁标准品的浓度具有较好线性关系。
1.2.4单因素试验设计(1)乙醇浓度：取1.0000g黄花草粉末，按料液比1∶20(g/mL)分别与30%，40%，50%，60%，70%的乙醇混合，提取功率30W，在60℃下超声提取20min，分析乙醇浓度对总黄酮得率的影响。(2)料液比：取1.0000g黄花草粉末，分别按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(g/mL)与50%乙醇混合，提取功率30W，在60℃下超声提取20min，分析料液比对总黄酮得率的影响。(3)提取功率：取1.0000g黄花草粉末，按料液比1∶15(g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为30，40，50，60，70W，在60℃下超声提取20min，分析提取功率对总黄酮得率的影响。(4)提取温度：取1.0000g黄花草粉末，按料液比1∶15(g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为40W，分别在30，40，50，60，70℃下超声提取20min，分析提取温度对总黄酮得率的影响。(5)超声时间：取1.0000g黄花草粉末，按料液比1∶15(g/mL)与50%乙醇混合，提取功率分别为40W，在50℃下分别超声提取20，30，40，50，60min，分析超声时间对总黄酮得率的影响。
1.2.5正交试验设计在单因素试验基础上，以对总黄酮得率影响较大的4个因素设计L9(3)4正交试验，以黄花草总黄酮得率为评价指标，优化黄花草总黄酮提取工艺。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1乙醇浓度对黄花草总黄酮得率的影响
适当提高乙醇浓度，总黄酮得率增大。这是因为随着乙醇浓度增大，溶剂与黄酮类成分的极性越来越接近，黄花草细胞发生溶胀现象，有利于总黄酮溶出。当乙醇浓度为50%时，黄花草总黄酮得率达到最大。继续增加乙醇浓度，溶剂与黄酮类成分的极性差异增大，影响了黄酮类成分的溶解性[14]，而且黄花草中醇溶性杂质大量溶出，这些杂质与黄酮类成分竞争溶剂，导致总黄酮得率减小。因此，选择最佳乙醇浓度为50%。
2.1.2料液比对黄花草总黄酮得率的影响
随着料液比增大，黄花草总黄酮得率先增大后减小。这是因为在一个合适的料液比范围内，增加溶剂，黄花草细胞内总黄酮和溶剂的浓度差增大，加大了传质效率，有利于总黄酮溶出[15]，因此，总黄酮得率增大。当料液比为1∶15(g/mL)时，总黄酮得率最大。继续增加料液比，溶剂量过大，超声辅助效果减小，还会加大非黄酮类成分的溶出，导致总黄酮得率减小[16]。因此，选择最佳料液比为1∶15(g/mL)。
3结论
试验通过超声波辅助法，以黄花草总黄酮得率为评价指标，研究了黄花草提取总黄酮的最佳工艺，并研究了其抗氧化活性。得到黄花草总黄酮的最佳提取工艺为：料液比1∶15(g/mL)，乙醇浓度50%，提取功率40W，超声时间50min，提取温度50℃，此条件下得到黄花草总黄酮得率为(2.711±0.002)%。抗氧化试验结果表明，在考察的浓度范围内，黄花草的抗氧化能力随总黄酮浓度增加而增强，当总黄酮浓度为0.25mg/mL时，对·OH、DPPH·和亚硝酸盐的清除率分别为(52.48±0.88)%，(95.58±0.28)%，(57.27±0.15)%。上述表明，黄花草中的总黄酮是一种活性较好的抗氧化剂，具有较大潜在研究价值。试验仅研究了黄花草总黄酮的超声辅助提取工艺及抗氧化活性，采用其它提取技术总黄酮得率如何，黄花草中总黄酮的开发利用还有待进一步研究。
参考文献
[1]肖泽华，李欣航，潘高，等.锰胁迫对黄花草种子萌发及幼苗生理生化特征的影响[J].草业学报，2019，28(12)：75-84.
[2]陈文红，司马永康，王慷林，等.滇东南的山柑科野生植物种类及其利用价值[J].云南林业科技，2000(3)：23-27.
[3]PARIMALADEVIB,BOOMINATHANR,MANDALSC.StudiesonanalgesicactivityofCleomeviscosainmice[J].Fitoterapia,2003,74(3):262-266.
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