马铃薯野生种冷驯化能力的蛋白组学分析

　　摘要为研究马铃薯冷驯化机理，通过同位素相对标记与绝对定量技术(isobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ)分析了冷驯化过程中(0,4和12d)马铃薯野生种Solaumacaule(W3,具备冷驯化能力)和S.cardiophyllum(Cph12,无冷驯化能力)的蛋白质组变化。结果表明：在W3和Cph12中筛选的可信蛋白质数量分别为2126和1044;在冷驯化早期分别筛选到103与56个差异表达蛋白，后期分别筛选到330和155个;富集到与耐寒性或冷驯化直接相关的途径27条，例如膜脂质成分的调节，渗透保护剂的合成，抗氧化代谢，能量代谢和光合作用等。本研究结果为深入研究马铃薯冷驯化的分子机制提供理论指导，也可为马铃薯抗寒基因挖掘及分子育种提供参考。

　　关键词马铃薯;冷驯化;蛋白组学;差异表达蛋白

　　低温是植物生长过程中面临的主要非生物胁迫之一，植物的生长发育与生理代谢直接受到低温的影响。而马铃薯普通栽培种(SolanumtuberosumL.)对霜冻敏感。马铃薯植株在气温低于7℃时停止生长，-0.8℃受冷害，-1.5℃受冻害(许娟等,2016)，后两者经常造成马铃薯大幅度减产(李飞等,2014)。植物经过非致死温度的低温处理可以获得更强的抗寒能力，这种现象被称为冷驯化(Thomashow,1999)。

　　植物应答低温胁迫时通过冷驯化做出的自我保护响应，可提高作物的低温适应性在农业生产中对具有重要作用，然而冷驯化是一个复杂的过程，涉及若干生化和生理变化(Johnetal,2016)。因此研究马铃薯冷驯化作用机制具有极为重要的现实意义。近年来国内外学者对作物冷驯化机制进行了大量研究。John等(2016)研究发现生物膜脂质不饱和度和磷脂含量的增加以及细胞内渗透保护剂的积累在通过冷驯化提高植物抗冻性中发挥重要作用。

　　如Shahandashti等(2013)研究表明，冷驯化后不饱和脂肪酸比例增加，是鹰嘴豆耐寒性提高的标志;谢冬微等(2013)对冬小麦的研究表明，亚麻酸和棕榈酸与抗寒性密切相关，同时不饱和脂肪酸增加导致抗寒性增强;渗透保护剂脯氨酸在包括玉米ZeamaysL.(DuncanandWidholm,1987)。此外植物冷驯化和抗冻性还涉及到其他代谢途径，例如，植物的抗氧化能力可能是植物抗寒机理的重要组成部分(朱政等,2011);光合作用为冷驯化过程提供了碳骨架和能量(Normanetal.,2013);多胺通过减少氧化应激来保护膜(KrasenskyandJonak,2012)。不同植物的冷驯化能力差异是由基因决定的(Kurepinetal.,2013)。

　　组学技术的快速发展在作物非生物胁迫中得到广泛应用，为抗逆基因的挖掘研究及代谢途径提供重要思路。目前，有关马铃薯冷驯化的蛋白质组研究少有报道，本研究通过iTRAQ技术对马铃薯野生种S.acaule(W3,抗冻具冷驯化能力)和S.cardiophyllum(Cph12,霜冻敏感不具冷驯化能力)在冷驯化期间蛋白质组的变化进行分析，研究结果有助于揭示马铃薯野生材料冷驯化能力涉及的生理机制，为马铃薯抗寒机制的深入研究和分子育种提供参考。

　　1结果与分析

　　1.1iTRAQ分析

　　从冷驯化前(0d)、冷驯化中(4d)与冷驯化后(12d)的野生材料W3与Cph12中分别取样进行iTRAQ分析(其中0d取2个生物样,4d与12d各取3个生物样)。各样品总蛋白抽提后，进行SDS-PAGE检测;确认蛋白样品合格后，将胰蛋白酶酶解、标记，接着取等量的各标记样品混合后再进行色谱分离。经过串联质谱检测，分别鉴定出9642与6200个肽段。主成分分析结果显示，样品的重复性符合要求。最终，鉴定出可信蛋白质为W3中2126个，Cph12中1044个。

　　1.2差异表达蛋白筛选

　　按照4/0d和12/4d的比较组设定，冷驯化前期(4/0d)，马铃薯野生材料W3中共筛选到差异表达蛋白103个(上调表达58个,下调表达45个)，Cph12中筛选到差异表达蛋白56个(上调表达30个,下调表达26个);冷驯化后期(12d/4d)，马铃薯野生材料W3中共筛选到差异表达蛋白330个(上调表达183个,下调表达147个)，Cph12中筛选到差异表达蛋白155个(上调表达95个,下调表达60个)。通过归并重复项，马铃薯野生材料W3中共获得的动态变化蛋白数为404个，Cph12中为248个，这部分动态变化蛋白可以很好的诠释在不同差异比较组中蛋白的表达模式。

　　1.3GO注释

　　对各比较组中的DEPs进行GO注释，并分3个类别生物过程(Biologicalprocess)、细胞组分(Cellularcomponent)与分子功能(Molecularfunction)进行富集分析。与DEPs筛选结果类似，在冷驯化后期(12d/4d),W3与Cph12中富集到的GO项大幅度增加,W3中增加幅度大于Cph12。按P-value值大小排序，在生物过程分析中，对比组C4/C0富集到的前10个GO项中有5个与光合作用相关的，其中光合作用、光反应、暗反应在对比组C12/C4、W4/W0与W12/W0中也被富集到，但是排名较为靠后。

　　与此相反，小分子代谢过程、草酸代谢过程、有机酸代谢过程等GO项在对比组C12/C4、W4/W0与W12/W0中排名前10，而在对比组C4/C0排名较为靠后。在细胞组分分析中，各对比组前8位均相同，包括细胞(Cell)、细胞部分(Cellpart)、细胞内(Intracellular)、细胞内部分(Intracellularpart)、细胞质(Cytoplasm)、细胞内的细胞器(Intracellularorganelle)、细胞器(Organelle)及胞质部分(Cytoplasmic。

　　1.4KEGGPathway分析

　　通过OmicsBean组学数据的整合分析云平台，利用KEGGPathway对差异表达蛋白分析(P-value<0.05)，W3中富集到85个Pathway，Cph12中富集到68个Pathway。在富集到的Pathway中，包括了膜脂组分调节、渗透保护剂合成、抗氧化相关代谢、能量代谢、光合作用、次生代谢物(如苯丙醇和二羧酸)等与植物抗寒性或者冷驯化能力直接相关的Pathway。

　　W3中富集到上述类型Pathway27个，涉及差异表达蛋白84个，这些差异表达蛋白中有62个的丰度变化表现为先升高后降低，占73.8%;Cph12中富集到23个通路，涉及差异表达蛋白43个，其中有29个差异表达蛋白丰度变化规律为先降低后升高，或者持续升高，占69.05%。

　　2讨论

　　2.1差异表达蛋白数量与抗寒性积累的关系

　　冷驯化前期(4/0d)，马铃薯野生材料W3中共筛选到差异表达蛋白103个，Cph12中筛选到差异表达蛋白56个;冷驯化后期(12/4d)，马铃薯野生材料W3中共筛选到差异表达蛋白330个，Cph12中筛选到差异表达蛋白155个，因此冷驯化后期(12/4d)，在W3和Cph12中筛选的DEP是早期(4/0d)的3倍。

　　与DEP筛选结果相似，在后期冷适应期(12/4d)富集的GO项数量显着增加，并且W3的增加大于Cph12。DEPs和GO项的数量变化与Wu等(2019)前期研究中马铃薯抗冻性变化一致。在富集到的代谢过程中，有许多途径与植物的抗寒性直接相关，包括膜脂质成分，渗透保护剂，抗氧化剂以及能量和碳骨架。同时，W3和Cph12中的富集到的代谢途径基本相同。然而，在每个途径中，W3中的差异表达蛋白数量大于Cph12，这表明W3中与寒冷适应相关的代谢网络的“动员度”更高，从而增强了植物的抗寒性。

　　2.2生物膜组分变化与冷驯化能力的关系

　　Yadav(2010)研究表明，低温下冰的形成导致植物组织脱水，在细胞壁和质膜上造成机械损伤，造成细胞破裂和细胞器完整性的丧失，是低温下植物损伤的真正原因。不饱和脂肪酸(包括亚油酸,亚麻酸,棕榈酸等)熔点较低，可以降低生物膜的相变温度(Haraetal.,2003)，高不饱和脂质水平有助于维持叶绿体在低温下的膜功能(Zhangetal.,2009)。脂肪酸不饱和度和磷脂含量的增加与对冷冻应激的耐受性有关(Moelleringetal.,2010)。Vega等(2004)研究发现，野生马铃薯种S.commersonii冷驯化过程中膜甘氨酸亚油酸在叶片中积累，在其他马铃薯中未发现这种特性。

　　本研究中，α-亚麻酸代谢、亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢、甘油脂代谢、脂肪酸降解与脂肪酸生物合成等与膜脂组分代谢相关的通路在W3冷驯化过程中被富集到，其中前5条通路在Cph12中也被富集到，但是W3中涉及差异表达蛋白数量(13个)高于Cph12(6个)。

　　项目组前期(Wuetal.,2019)研究表明：冷冻处理后，未经冷驯化的W3叶肉细胞中液泡解体，叶绿体被膜受到一定破坏;随着冷驯化时间的延长，细胞器在冷冻处理中受到的损伤逐渐减少;冷驯化12d后，各细胞器无明显损伤;同时，植株叶片在冷冻处理中的受损程度与其相对电导率成显着相关。未经冷驯化的Cph12冷冻处理后的表现与W3类似;冷驯化后，各细胞器在冷冻处理中受到的损伤仅有轻微减轻。由此推测，冷驯化可以通过调节脂肪酸的生物合成途径来改变W3的细胞膜成分，从而减少在低温条件下对其膜结构的破坏。

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　　3材料与方法

　　3.1试验材料

　　马铃薯野生材料W3和Cph12引自国际马铃薯中心。试管苗种植于贵州省农科院学院温室大棚(106˚39’59’’E,26˚30’20’’N)。在苗期(植株有5~7片完全展开的复叶)取长势一致的植株，在人工气候箱(AHRP-2000D,常州)内培养2d(温度20℃±0.5℃、相对湿度70%±5%、14h/10h光暗培养、光照强度100μmol•m-2g-1);随后开始进行冷驯化，驯化条件为：白天4℃/14h，光照强度100μmol•m-2g-1;夜间2℃10h，黑暗。在冷驯化第0天、第4天和第12天，分别取W3和Cph12植株叶片(从顶端往下第3,4片展开复叶)用于蛋白组学及生物信息学分析。

　　3.2iTRAQ分析

　　取W3和Cph12冷驯化0d(2个生物重复)、4d(3个生物重复)与12d(3个生物重复)的叶片(从顶部往下第3片展叶)用于iTRAQ分析。提取样品叶片的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，并用12%SDS-PAGE电泳进行检测。通过对胰蛋白酶溶液进行测序来消化蛋白质样品，并用iTRAQ试剂进行标记。

　　参考文献：

　　ChenL.J.,XiangH.Z.,MiaoY.,ZhangL.,GuoZ.F.,ZhaoX.H.,LinJ.W.,andLiT.L.,2014,Anoverviewofcoldresistanceinplants,JournalofAgronomyandCropScience,200(4):237-245.

　　DuncanD.R.,andWidholmJ.M.,1987,Prolineaccumulationanditsimplicationincoldtoleranceofregenerablemaizecallus,PlantPhysiology,83(3):703-708.

　　GrimaudF.,RenautJ.,DumontE.,SergeantK.,LucauDanilaA.,BlervacqA.S.,SellierH.,BahrmanN.,LejeuneHénautI.,DelbreilB.,andGoulasE.,2013。

　　Exploringchloroplasticchangesrelatedtochillingandfreezingtoleranceduringcoldacclimationofpea(PisumsativumL.),JournalofProteomics,80(27):145-159.

　　作者：何天久李飞吴巧玉*

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