氧化石墨烯对拟南芥生长的促进作用

　　摘要：明确氧化石墨烯(grapheneoxide，GO)对拟南芥生长的促进作用，为纳米材料应用于农业生产提供理论依据。采用不同浓度GO的1/2MS培养基点拟南芥种子，测定其主根长、侧根数、根系活力、超氧阴离子自由基的产生、超氧化物歧化酶活性、根系生长相关基因的表达情况。经20~200μg/mLGO处理后，拟南芥主根长度比对照(不加GO)提高了4.6%~43.0%，在50~200μg/mL内，与对照相比，差异达显著水平。50μg/mL处理显著促进了侧根形成，侧根数比对照增加了约27.1%，高于或低于50μg/mL则不利于侧根的形成。表明50μg/mLGO对拟南芥的主根长和侧根数均存在促进作用，同时还发现该浓度可以增加拟南芥根尖的分生区和伸长区的长度，而对根尖直径和根冠长度无影响。氯化三苯基四氮唑(TTC)和四硝基氮蓝四唑(NBT)组织染色法结果表明50μg/mLGO浓度处理提高了根系活力和超氧化物歧化酶活性及降低了超氧阴离子的产生。基因表达分析显示ADC1和DAR2表达量下调和IQM3表达量上调，从而促进了主根的伸长;ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3表达量上调，从而促进了侧根数量的增加。50μg/mLGO处理可促进拟南芥根系的生长。根系活力的增加、超氧阴离子的减少及根相关基因的表达上调是GO促进根系生长的主要原因。

　　关键词：拟南芥;氧化石墨烯;纳米材料;根系生长;基因表达

　　纳米材料具有优异的光学、电学、力学特性，在材料学、微纳加工、能源、生物医学和药物传递等方面具有广阔的应用前景[1]。石墨烯是目前常用的一种碳纳米材料。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的氧化物，也是一种碳纳米材料，因其含氧官能团增多而使其性质较石墨烯更加活泼。碳纳米材料已拓展至农业，它能影响植物生长和发育的过程及其生长的环境[2-5]。研究表明，它对植物生长有促进作用。如石墨烯碳纳米材料能促进植物呼吸和根系生长，减少氨的挥发，提高产出率、保障安全生产等[6]。在肥料中添加石墨烯碳纳米材料能提升肥料利用率、促进种子发芽和农作物生长[7]。

　　但是，也有纳米材料抑制植物生长等负面影响的报道。如一定浓度的纳米材料可降低发芽率、抑制植物生长甚至导致植物枯萎死亡;抑制蛋白质合成和细胞分裂甚至导致植物基因水平的损伤，对植物造成毒性效应[8]。还有研究报道纳米材料对植物生长的影响效果和处理浓度之间关系密切，不同浓度的处理可能产生截然不同的结果[6-9]。目前，纳米材料对植物生长影响的研究还处在初始阶段，许多结论还不完善和统一，GO在植物方面的报道更少。拟南芥是一种模式植物，其生长周期短。

　　本研究选用GO纳米材料，设置不同GO浓度培养拟南芥，测定其主根长和侧根数等形态指标，以明确其影响效果与GO处理浓度的关系，确定促进生长的最适宜浓度。进一步分析拟南芥幼苗中超氧阴离子自由基(O2·-)的产生、超氧化物歧化酶(SOD)活性和根系活力等生理指标，再分析其对拟南芥根生长相关的基因表达情况，进一步明确纳米材料GO对植物生长的影响及其内在机制，为其应用于农业生产提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　材料为拟南芥野生型(Col-0)，种子用70%乙醇和20%漂白剂进行表面消毒，无菌水清洗后将其点在方形培养皿(10cm×10cm)中萌发(灭菌的1/2MS固体培养基，含有0.8%琼脂和1%蔗糖)。将10g氧化石墨烯(GO)粉末溶解于1L去离子水中，并灭菌。

　　将超声处理1h的GO溶液与灭菌的1/2MS培养液混合，形成GO浓度分别为0、20、50、100和200μg/mL的培养基(下文简称GO/MS培养基)。在各培养基上分别播种30~40粒种子，重复3次，4℃放置2d，然后转至20℃/22℃，16h(昼)/8h(夜)的光周期和100μmol/(m2·s)的光照强度下的人工气候室(全友，南京)中生长。

　　1.2方法

　　1.2.1GO的形貌表征

　　首先在扫描电子显微镜样品台上贴好导电胶，然后将干燥好的GO贴在导电胶上，在电流约为4mA条件下将样品喷金30~40s。在15kV加速电压下，用扫描电子显微镜(SEM，ZEISSGeminiSEM300)观察GO的表面形态，并拍照。将GO分散到水中，超声分散30min，取5μL滴加到镀有碳膜的铜网上，自然风干后用透射电子显微镜(TEM，TalosF200X)观察GO纳米结构。通过傅里叶红外光谱法(FTIR，TENSOR27红外光谱仪)对GO进行表征。FTIR测定红外光谱波数范围为500~4000cm-1。

　　1.2.2主根长和侧根数的观察对生长在不同浓度GO/MS培养基中6d的拟南芥植株进行拍照，并使用ImageJ1.53软件测量主根长。对生长11d的拟南芥植株进行拍照(为便于保存，拍摄时已通过2.5%戊二醛固定)，并人工统计其侧根数。

　　1.2.3主根根尖各部分大小的分析对生长在不同浓度GO/MS培养基中4d的拟南芥主根进行碘化丙啶(propidiumiodide，PID)染色，用激光共聚焦显微镜(Leica，SP8)拍摄其根部的不同区域，再用ImageJ1.53软件测量分生区、伸长区、根尖直径和根冠大小。

　　1.2.4SOD活性和根系活力的测定

　　采用四硝基氮蓝四唑(nitrobluetetrazolium，NBT)和氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazoliumchloride，TTC)染色法分别进行O2·-和根系活力的测定，所有的样品均处理6d。CO2·-的测定是将拟南芥幼苗放在含1%NBT的20mmol/L磷酸钾缓冲溶液中，抽真空后用蒸馏水洗去染液，用70%乙醇溶液90℃脱色20min，然后用立体显微镜(Leica，S8AP0)观察并拍摄，拟南芥幼苗着色的深浅来表示O2·-产生的多少。根活力的测定是将根浸在2%TTC染液中，37℃放置5h，立体显微镜观察并拍摄。根着色深浅表示根活力的高低。采用WST法测定SOD活性，样品的提取及测定参照试剂盒(建成，南京)的说明书来进行。

　　1.2.5根生长相关基因表达

　　以生长在1/2MS(含有GO浓度为0和50μg/mL)培养基中的拟南芥为基因表达分析材料，分别选取6及11日龄的拟南芥用于分析其主根和侧根生长相关基因的表达。样品经液氮研磨，用TRIZOL法提取总RNA，利用cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以ACT2(At3g18780)为内参基因，参照Cao等[10]方法，通过荧光定量PCR分析其基因表达水平。1.2.6统计分析采用SPSS20.0和origin进行统计分析和作图。采用Ducan检验法统计差异。试验重复3次。

　　2结果

　　2.1GO的表征

　　GO呈膨胀状态，由多个片层叠加而成，表面显示有褶皱，原因主要是多层GO叠加之后及自然状态下单层GO为保证状态的稳定而自动成为褶皱结构。超声后的GO以单片层或少数几层叠加的形式存在，其特征峰出现在波长3237(O-H的伸缩振动)、1712(酯C=O的伸缩振动)和1041cm-1(C-O的伸缩振动)，均为GO的含氧官能团。

　　2.2不同GO处理浓度对拟南芥生长的影响

　　不同浓度GO培养拟南芥6d后，与对照相比，经GO处理的拟南芥主根长均明显增长，分别提高了4.6%、43.0%、31.7%和30.5%，其中，经50μg/mLGO浓度处理的拟南芥主根最长，约为26.5mm。

　　随GO处理浓度的增加，根长呈现有规律的变化，先升高，于50μg/mLGO浓度时达到最高，随后又逐渐降低。表明GO对拟南芥主根的生长有促进作用，但作用效果与处理浓度有关，适宜的浓度效果最好，过高或过低都会降低其效果。因此，促进拟南芥主根生长的GO适宜处理浓度约为50μg/mL。不同浓度GO培养拟南芥11d后，观测其侧根的生长情况。

　　与对照相比，200μg/mL高浓度处理和20μg/mL低浓度处理会抑制侧根数的形成，分别比对照减少了20.2%和24.0%;而50μg/mL中等浓度处理却能够显著增加侧根数，约增加了27.1%;另外，100μg/mL浓度处理则无显著变化。表明不同浓度的GO对拟南芥生长可能会产生促进、抑制和无效3种情况，在一定程度上解释了前人不同试验结论的原因，不同浓度处理可以产生完全不同的结果。和主根一样，促进侧根生长的适宜浓度约为50μg/mL。

　　2.3GO对拟南芥根系生长的促进作用

　　用50μg/mLGO浓度培养拟南芥，测定其形态和生理生化等指标，进一步探讨GO促进根系生长的内在机制。

　　2.3.1GO对拟南芥根区不同部位生长的影响50μg/mLGO浓度培养拟南芥4d后，测量其根尖不同区域的长度，发现GO处理后的拟南芥主根分生区和伸长区的长度显著增加，但根尖直径和根冠长度并无显著变化。表明GO主要是通过分生区和伸长区而促进根系生长。

　　2.3.2GO对拟南芥超氧阴离子自由基、SOD活性和根系活力的影响

　　通过TTC和NBT对组织进行染色，进一步分析GO处理对拟南芥幼苗中的超氧阴离子自由基O2·-水平和根系活力造成的影响。TTC染色法是常用的鉴定根系活力的方法。在GO/MS培养基中生长6d拟南芥的主根经TTC染色，发现50μg/mLGO处理植株的颜色明显深于对照组，组织着色越深表明根系活力越强;反之，根系活力越弱。

　　表明适宜的GO浓度可以提高拟南芥的根系 活力。经50μg/mLGO处理的拟南芥幼苗颜色较浅，而对照植株的颜色相对较深。表明适宜的GO浓度处理提高了拟南芥幼苗中SOD的酶活性，从而减少了超氧阴离子自由基水平。此外，通过WST法对SOD活性进行了定量分析，发现经50μg/mLGO处理的拟南芥幼苗的SOD活性显著高于对照，其活性约增加43.6%。这印证了NBT的染色结果。

　　2.3.3GO对拟南芥根生长相关基因表达的影响

　　通过对不同浓度GO处理下拟南芥根相关基因的表达检测。与对照相比，ADC1和DAR2的表达量下调，而ERFII-1的表达量则变化不大，IQM3的表达量上调，且达到显著水平。表明在GO的影响下，可导致ADC1和DAR2下调和IQM3上调，进而促进了根长的增加。与对照相比，侧根生长相关的基因ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表达量在GO处理后都表现为显著上调，分别增加了150.0%、51.0%、312.0%和83.0%，CKX1的表达量则没有明显改变。表明适宜浓度GO处理可使ARF7、ARF19、ERFII-1和IQM3的表达量上调，进而促进了侧根数量的增加。

　　3讨论

　　3.1不同GO浓度处理对植物生长的影响分析

　　本研究结果表明，在20~200μg/mL浓度处理范围内，随着GO浓度的增加，对拟南芥主根长均表现为促进作用，20μg/mL处理促进作用不明显，但随着浓度增加促进效果增强，到50μg/mL时促进作用达到最大，然后随浓度升高促进效果下降，但50~200μg/mL浓度促进作用均达到显著水平;GO对侧根生长的影响则是20μg/mL低浓度处理和200μg/mL高浓度处理均会抑制侧根数的形成，而50 μg/mL中等浓度处理却能够显著增加侧根数。

　　如果将抑制作用理解为促进作用的负增长，则GO影响主根和侧根生长的浓度响应趋势非常类似，先是随着处理浓度升高而促进作用效果增加，达到一个峰值后浓度增加而其效果则下降。无论是主根还是侧根，50μg/mL浓度处理促进生长的效果最好。本研究明确了GO处理对拟南芥生长的影响，但作用效果与处理浓度显著相关，不同的处理浓度可能会产生促进或抑制完全相反的2种效果。

　　本研究中，GO处理对主根生长没有产生抑制效果，可能是由于浓度范围设置过窄，没有达到抑制主根生长的处理浓度，根据处理产生的效果趋势，如果继续增加处理浓度，很可能会出现抑制主根生长的处理效果，有待进一步试验验证。Park等[9]也证实了GO可促进拟南芥的生长，但其试验浓度和效应与本研究结果不一致。认为GO浓度为0.1μg/mL时可促进拟南芥叶面积的增加，在0.1~1.0μg/mL范围内可促进开花的数量，但对根的长度没有影响。造成这种差异的原因可能是不同器官对GO处理的响应浓度不同，根系需要更高的浓度处理。Park等[9]的GO处理最高浓度仅为1.0μg/mL，可促进花和叶的生长，却不能影响根的生长。

　　本研究增加处理浓度，可以明显看到GO处理对根系生长的影响。所以，同一植物的不同器官对GO处理的响应浓度是不一样的。GO对植物的影响，还与植物的种类有关，不同种类的作用效果和响应浓度不同。有研究表明，经5和50mg/L的石墨烯处理的水稻根长与对照组并无明显差异，而在100和200mg/L的处理中则表现为抑制，没有显示石墨烯处理对其生长的促进作用[11]。另有研究表明，10μg/mL的GO处理促进了西瓜的生长，增加了其周长，并能增强植物的稳定性[9]，与本研究结果相比，促进西瓜生长的GO处理浓度要低。

　　4结论

　　GO是一种重要的碳纳米材料，能促进拟南芥根系生长，但作用效果和处理浓度显著相关。在本试验条件下，50~200μg/mL处理显著促进拟南芥主根的伸长;50μg/mL浓度处理显著促进拟南芥侧根数的形成，但20μg/mL低浓度处理和200μg/mL高浓度处理会抑制侧根数的形成。

　　参考文献：

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　　作者：高聪 萧楚健 鲁帅 王苏蓉 袁卉华 曹云英

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