本文摘要：摘要对3种品系藜麦(黑藜麦、红藜麦和黄藜麦)进行体外模拟消化，研究多酚类物质和黄酮类物质及其抗氧化性的变化情况。结果表明：总多酚含量为黑藜麦红藜麦黄藜麦(0.05黑藜麦黄藜麦(0.05)。经体外模拟消化后，口腔、胃和小肠能显著促进多酚类物质和黄酮类物质
摘要对3种品系藜麦(黑藜麦、红藜麦和黄藜麦)进行体外模拟消化，研究多酚类物质和黄酮类物质及其抗氧化性的变化情况。结果表明：总多酚含量为黑藜麦>红藜麦>黄藜麦(<0.05>黑藜麦>黄藜麦(<0.05)。经体外模拟消化后，口腔、胃和小肠能显著促进多酚类物质和黄酮类物质的释放(<0.05frapabts>小肠>胃>大肠(<0.05)，且藜麦消化液抗氧化性与多酚类和黄酮类物质释放量呈显著正相关。经体外消化后藜麦中结合型多酚类化合物(没食子酸、阿魏酸等)被显著释放，表现出较高的生物活性，使藜麦具有较高的营养健康价值。
关键词藜麦;体外消化;多酚;黄酮;抗氧化性
藜麦原产于南美洲安第斯山区秘鲁和波利亚境内的“喀喀湖”沿岸，为一年生草本植物，其籽粒作为当地居民传统的主食，有着“粮食之母”之称，目前主要种植在秘鲁、智利、厄瓜多尔等高海拔地区[1]，而我国山西、青海等地也已进行种植推广[2]。藜麦籽颜色多样，主要有红、白、黄、黑等，营养学研究发现颜色的差异与其内部的营养成分密切相关，即颜色越深其营养价值越高[3-4]。
藜麦籽粒中蛋白质、必需氨基酸、膳食纤维、矿物质等营养成分高于一般类谷物[5]，同时富含多酚类化合物和黄酮类等活性物质，其中酚类化合物主要为酚酸(如没食子酸、阿魏酸)、槲皮素和芦丁，而常见谷物小麦、燕麦、黑麦中均不含黄酮类化合物[6-8]。多酚类化合物具有提高人体免疫力、抗癌、预防心血管病等功效;黄酮类能够降血糖、降血脂、抗病毒等，因此藜麦具有较高的营养保健价值[9]。基于藜麦中多酚类化合物种类多且含量高，大量研究者对藜麦的生物活性进行了测定。Abderrahim等[10]发现秘鲁有色藜麦中总多酚(1.23～3.24mg/g)和总黄酮(0.47～2.55mg/g)含量较高，表现出较强的抗氧化能力(119.8～335.9mmol/kg)。
Tang等[11]发现藜麦中酚类化合物十分丰富，并且深色藜麦种子中酚类物质含量高且具有较强的抗氧化性。尽管目前藜麦被大量的研究证实具有较强的体外抗氧化性等生物活性，还不能因此直接预测其对人体健康的影响。Rein等[12]提出应当对其活性成分的生物可达性进行评估，因为活性成分只有经消化过程中各阶段的释放吸收才能发挥益处。目前对藜麦的研究多集中在优化活性成分的提取及体外生物活性的研究上，对于其体外模拟消化过程中活性物质的变化情况未有详细报道。本文以黑藜麦、白藜麦以及黄藜麦为研究对象，体外模拟消化研究各消化阶段(口腔、胃、小肠和大肠)藜麦消化液中多酚类与黄酮类活性成分的变化情况以及抗氧化活性，探讨藜麦对于人体的营养贡献，为不同品种藜麦加工副产物的综合利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1试验材料
黑藜麦、红藜麦和黄藜麦：2018年9月采收于西藏自治区农牧科学院农业研究所现代农业示范园区，品系分别为30号、ZL-06和ZL-05。将藜麦粉碎后过60目筛，分别密封于自封袋中，置干燥箱中备用。
1.1.2试剂甲酸、福林-酚试剂、三氯化铝、三氯化钙、乙醇、盐酸、氯化钾(分析纯)，成都市科龙化工试剂厂(分析纯);乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Mreda公司;水溶性VE、胃蛋白酶、α-淀粉酶、胰蛋白酶、胆汁、戊聚糖复合酶，sigma公司;没食子酸、芦丁、阿魏酸、槲皮素(纯度98%)、2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、菲洛嗪，北京索莱宝科技有限公司。
1.2设备与仪器FW-100高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司;TD-4Z型台式低速离心机，四川蜀科仪器有限公司;KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Gentrifuge5180R型冷冻干燥机，德国Eppendorf公司;SynergyHTX型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司;UV-6100型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司;1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。
1.3试验方法
1.3.1模拟体外消化试验
体外消化试验参照Qin等[13]的方法略作修改。称取2.0g藜麦粉末置于离心管中，加入20mL蒸馏水，用柠檬酸调节pH值至6.5，加入1mLα-淀粉酶溶液(酶活75U/mL)后置于37℃水浴震荡10min，8000r/min离心10min，将上清液(S1)倒出，备用。
向残渣中加入20mL蒸馏水，用6mol/LHCl调节pH值至=2，随后加入105.6mg胃蛋白酶，置于37℃水浴震荡2h后8000r/min离心10min，将上清液(S2)倒出，备用。继续向残渣中加入18mL蒸馏水，用2mol/LNaHCO3调节pH值至7.4，加入1mL胰蛋白酶(10mg/mL)与1mL胆酸盐溶液(65mg/mL)，置于37℃水浴震荡2h后8000r/min离心10min，将上清液(S3)倒出，备用。向残渣中继续加入20mL蒸馏水，用6mol/LHCl调节pH值至=4.0，加入80µL纤维素酶，置37℃水浴震荡16h后8000r/min离心10min，将上清液(S4)倒出，备用。
1.3.2藜麦中多酚和黄酮提取液[14]称取1g藜麦样品，加入8mL85%甲醇(含1%甲酸)，40℃超声提取30min，8000r/min离心15min，倒出上清液，备用。重复提取2次，合并3次提取液，定容25mL。
1.3.3总多酚的检测总多酚测定采用Folin-Ciocalteu法[15]。向20μL藜麦消化液或提取液中加入20μL福林酚试剂，摇匀后静置5min，加入160μL5%Na2CO3溶液，室温下避光反应60min，在波长765nm处测定吸光度。总多酚含量以没食子酸当量计算，单位为mg/g。
1.3.4总黄酮的检测
总黄酮采用氯化铝-亚硝酸钠比色法[16]测定。向20μL藜麦消化液或提取液中加入80μL蒸馏水和10μL25%NaNO2，反应6min后加入10μL10%AlCl3∙6H2O，反应5min后加入30μL(1mol/L)NaOH和100μL蒸馏水，于波长510nm处测定吸光值。总黄酮含量以儿茶素当量计算，单位为mg/g。
1.3.5抗氧化活性分析
1)ABTS+清除能力[17]将20µL藜麦消化液用蒸馏水稀释1倍，加入160µLABTS溶液混匀，避光反应6min，于波长734nm处测定吸光值。以水溶性VE质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线，得到回归方程：=12.895x+0.0363，²=0.998，线性范围为0.0～19.5µg/mL，测定结果以µg/mL表示。2)FRAP抗氧化能力[18]取30µL藜麦消化液，加入140µL蒸馏水，20µL2.1675mmol/LFeCl2，40µL5mmol/L菲洛嗪水溶液，混合避光反应20min，于波长562nm处测定吸光值。以水溶性VE质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线，得到回归方程：=0.0082x-0.0406，²=0.999，线性范围为14.15～107.46µg/mL，测定结果以µg/mL表示。
1.3.6多酚类化合物的分析[19]
将3mL藜麦消化液冷冻干燥后加入1mL甲醇溶解，经0.22µm微孔滤膜过滤后进样分析。色谱柱：Poroshell120PFP柱(4.6mm×100mm，2.7µm);DAD检测器，检测波长：280，320nm和350nm;柱温：30℃;流量：0.8mL/min;进样量5L;流动相：0.1%的甲酸水溶液(A)+乙腈(B)。梯度洗脱：0~10min，B5%~10%;10~20min，B10%~20%;20~35min，B20%~40%。
标准品溶液制备：将没食子酸、阿魏酸、芦丁和槲皮素4个标准品20mg分别用甲醇溶解并定容10mL作为标准品母液。利用梯度稀释法将母液配制成一系列浓度梯度的标准品溶液，备用。以没食子酸、阿魏酸、芦丁、槲皮素质量浓度(µg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。样品中多酚单体的含量计算公式如下：多酚单体含量(µg/g)=待测液中多酚单体浓度×稀释倍数×样品定容体积/提取质量。
1.3.7数据分析
所有试验重复3次，试验数据以平均值±标准差表示。采用SPSS17.0软件进行数据分析，通过单因素方差分析(ANOVA)进行显著性分析，P<0.05为差异显著。
2结果与分析
2.1总多酚含量的变化
藜麦富含多酚类物质和黄酮类物质，其良好的生理功能与之密切有关。利用模拟体外消化模型来评估消化过程中总多酚和总黄酮的释放情况，能间接反映藜麦的健康效应。显示体外模拟消化前、后总多酚的释放量。不同藜麦总多酚释放量大致具有相同的趋势，即经4阶段消化后，藜麦中总多酚均被显著释放，大致为口腔>小肠≥胃>大肠。其中，经口腔消化后，黒藜麦、红藜麦和黄藜麦总多酚释放量分别为4.16，3.82mg/g和2.67mg/g。口腔消化时间较短，而此阶段总多酚的释放量均较大，这与目前较多研究发现经口腔消化后仅有小部分多酚类物质被释放的结论不一致[20-21]。
然而，Zheng等[22]同样发现山楂中总酚类物质和黄酮类物质在模拟口腔消化过程中释放量超过65%。这些活性成分释放量的差异可能是由于生物活性和性质的不同所引起的。随着消化的继续，模拟胃消化后总多酚释放量分别为1.40，1.01mg/g和0.60mg/g，均显著低于口腔中的释放量。在低pH值环境中和胃蛋白酶的作用下能够释放一些与碳水化合物结合的酚类物质，从而使这些活性物质更具生物活性，然而，除黑藜麦外，胃消化后总多酚释放量均显著低于小肠释放量。这样的结果与Bohn等[23]相似，他们发现某些酚类物质可能在胃液中损失，导致许多酚类化合物在小肠消化过程中释放[24]。
经大肠消化后，由于大肠中普遍存在的肠道微生物所产生的酶进一步催化多酚类物质释放[25]，因此仍有少量的多酚类物质被释放。此外，不同品种藜麦消化略有差异，黑藜麦各消化阶段(除大肠消化液外)总多酚释放量显著高于黄藜麦和红藜麦，这是由于不同基因型的藜麦(黑色、红色和黄色)具有不同形式的酚类化合物，且总多酚含量与种子的颜色有关，即颜色越深，总多酚含量越高且抗氧化活性将更高[11]。
2.2总黄酮含量的变化
藜麦模拟体外消化过程中总黄酮释放量的变化趋势与总多酚相似。黒藜麦、红藜麦和黄藜麦中总黄酮含量分别为2.61，2.95mg/g和2.08mg/g，模拟消化后总黄酮被显著释放，释放量约为口腔>胃≥小肠≥大肠。经口腔消化后，黒藜麦、红藜麦和黄藜麦释放量分别为0.82，0.73mg/g和0.33mg/g，除黄藜麦外，总黄酮的释放均达到藜麦提取物的30%。此外，仅黒藜麦经胃消化后总黄酮量释放量显著高于小肠，其余均无显著差异，这可能是不同品种藜麦的活性成分的生物活性差异造成的;而小肠消化后总黄酮释放量降低的原因可能是藜麦中黄酮类化合物在碱性条件下不稳定，较容易降解为其它小分子化合物[26]。小肠消化液中总黄酮释放量与大肠并无显著差异，而随着消化的继续整体呈下降趋势，这与Qin等[13]的研究结果一致。
2.3抗氧化性的变化
为研究藜麦消化过程中可溶性组分的抗氧化能力，建立了2种抗氧化模型，即ABTS+自由基清除和FRAP抗氧化能力进行分析。从图4A可以看出，不同品种藜麦间抗氧化能力存在一定差异，其中黑藜麦在各消化阶段均表现出较高的ABTS+自由基清除能力，其次为黄藜麦。除小肠消化液外，藜麦消化液抗氧化能力表现出减弱的趋势，其ABTS+自由基的清除能力表现为口腔>小肠>胃>大肠。
这与大量体外消化试验发现胃和小肠阶段抗氧化能力最高的结论相反，而在苹果或山楂果实的体外消化试验研究中同样发现其抗氧化化合物主要在口腔释放[22,27]。这可能是因为食物中酚类化合物以不同形式(游离酚或结合酚)存在，而藜麦中游离酚在口腔消化过程中随即溶出而释放，结合酚则经酶的作用后释放，因而口腔具有较高的抗氧化活性[28]。
此外，藜麦中丰富的多酚类化合物只有经肠内酶水解才能被消化吸收，这使得小肠消化液同样表现出较强的抗氧化能力[29]。由于藜麦中80%的多酚类化合物在体外仍具有生物活性[30]，因此藜麦在整个体外消化过程中均表现出较高抗氧化能力。藜麦消化液对FRAP抗氧化能力与ABTS+自由基清除能力大致保持一致。消化液中酚类和黄酮类化合物等物质能螯合机体内金属离子，抑制自由基酶活性[31]。黑藜麦同样表现出较高的FRAP抗氧化能力，然而，3种藜麦随着消化的继续，FRAP抗氧化能力均出现减弱的趋势，即口腔>小肠>胃>大肠。抗氧化试验表明藜麦在消化过程中抗氧化活性成分主要在模拟口腔和小肠中释放，少量在模拟胃和大肠消化过程中释放;相比之下，水果和多数谷类中抗氧化功能成分则主要在胃和小肠消化过程中释放[20,32]。
2.4主要酚类化合物含量变化
藜麦中酚类化合物种类繁多，为进一步明确具体的酚类化合物在消化过程中含量的变化情况，本研究选取藜麦中具有代表性的4种酚类化合物，即没食子酸、阿魏酸、芦丁和槲皮素进行体外消化跟踪研究。在藜麦提取物中未检测到没食子酸、槲皮素，而检测到较高含量的芦丁和少量的阿魏酸，这是由于藜麦中多酚类化合物以结合型为主，其常与木质素或多肽等结合，无法通过普通溶剂提取出来，且芦丁溶于乙醇，因此检测到较高含量的芦丁[33]。藜麦经体外模拟消化后，4种酚类化合物均被显著释放，释放量约为口腔>胃>小肠>大肠。
4种酚类化合物首先在口腔消化后被显著释放，这与总多酚含量变化情况相一致，其中芦丁释放量高于没食子酸、阿魏酸和槲皮素。经胃消化后，没食子酸、阿魏酸、芦丁和槲皮素均显著降低，这与李俶等[34]研究发现各酚酸类化合物含量在模拟胃液中无显著变化的结论相反。而Kroon等[35]发现小麦种子在胃和小肠消化后仅有少量的阿魏酸(2.6%)释放，这说明不同食品体系中活性成分具有不同的生物特性。藜麦经小肠消化后，没食子酸和阿魏酸继续释放，而释放量显著低于口腔和胃;黄藜麦中槲皮素也被显著释放，释放量达到13.84ug/g，这是由于肠道消化酶能够促进复杂的食品体系中多酚类化合物从小肠中进一步释放[36]。
消化末期，在大肠消化液中仅检测到少量的阿魏酸和没食子酸。大多的研究发现谷类中结合态多酚占总多酚的比例超过90%[37]，藜麦中高比例的结合型多酚在体外经酶水解、酸水解等方式破坏酯键、醚键等得以释放[33]，使其表现出较高的生物活性(抗氧化性)，因此消化后具有较高的保健价值。
食品论文投稿刊物：《食品科学》(FoodScience)创刊于1980年，由中国商业联合会主管，北京市食品研究所主办，《食品科学》编辑部编辑出版的国内外公开发行的食品专业技术性期刊。国际标准刊号：1002-6630，国内统一刊号：11-2206/TS，复合影响因子：1.093，综合影响因子：0.717，邮发代号：2-439。
3结论
3种藜麦富含多酚类物质和黄酮类物质，将其体外消化后显著释放出多酚类和黄酮类物质并表现出较高的抗氧化性。3种藜麦经口腔消化后释放出大量的多酚类物质和黄酮类物质，其次为小肠，在胃和大肠中少量释放，并且释放量与藜麦抗氧化性呈显著正相关。通过对几类多酚类化合物进行跟踪，发现芦丁在口腔和胃中持续显著释放，没食子酸在口腔、胃、小肠中持续释放，阿魏酸在口腔、胃、小肠和大肠中持续释放。不同品系的藜麦中槲皮素释放量差异较大。综上所述，体外模拟消化能较好地评价藜麦中活性成分的生物利用度。基于藜麦品系中各活性成分的差异，未来可系统研究不同品系藜麦中多酚化合物及黄酮类物质的代谢路径及其活性成分多酚单体。
参考文献
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作者：1向卓亚1，邓俊琳1，陈建1，朱永清1，夏陈1，林长彬1，杨开俊2，刘廷辉
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