胆炎康胶囊微生物限度检查方法适用性研究

　　摘要：目的建立适合胆炎康胶囊微生物限度检查的方法。方法按照2015版中国药典要求，依照样品成分，取稀释倍数为1:80的供试液，采用直径150mm平皿进行计数方法的回收试验，采用常规法(培养基分别为100mL，100mL，10mL)进行大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌的检查。

　　结果需氧菌、霉菌和酵母总数计数方法回收比值均大于0.7，高于药典最低值0.5规定;控制菌检查阳性对照组均能检出相应阳性菌。结论该方法适用性试验所建立方法重现性好，可用于胆炎康胶囊的微生物限度检查。

　　关键词：胆炎康胶囊,微生物限度,方法适用性试验

　　胆炎康胶囊由土大黄、黄岑、连钱草、虎耳草、小花清风藤等八味中药组成[1]，该品种属于具有独家批准文号的苗药品种，其功能为清热利湿，排石止痛[2]。药品微生物控制是药品安全性保障的重要措施[3]，对于非无菌药品来说微生物限度检查是保证微生物控制的有效手段。而建立符合中国药典规定的微生物限度检查方法，是实现药品微生物控制的重要前提。本研究通过药品方法适用性试验，制定了符合本品实际情况的微生物检查方法。

　　1材料与仪器

　　1.1试剂与药品

　　菌种：金黄色葡萄球菌，CMCC(B)26003;铜绿假单胞菌，CMCC(B)10104;枯草芽孢杆菌，CMCC(B)63501;乙型副伤寒沙门菌，CMCC(B)50094;大肠埃希菌，CMCC(B)44102;黑曲霉，CMCC(F)98003;白色念珠菌，CMCC(F)98001;均购自中国食品药品检定研究院。

　　培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA、胰酪大豆胨琼脂培养基TSA、沙氏葡萄糖液体培养基SDB、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、肠道增菌培养基、麦康凯琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂，均购自北京陆桥技术股份有限公司;胰酪大豆胨液体培养基TSB、麦康凯液体培养基均购自北京三药科技开发公司;RV沙门菌增菌液体培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。药品：胆炎康胶囊(批号：20170706、20170903、20171204，贵州百灵企业集团制药股份有限公司)。

　　1.2主要仪器

　　生物安全柜(BSC-00ⅡB2，苏净安泰)、水浴锅(DK-98-ⅡA，天津泰斯特)、低温培养箱(KB240，BINDER)、恒温培养箱(BF240，BINDER)。

　　2方法与结果

　　2.1菌液制备

　　参照2015版中国药典四部通则1105、1106[4]“菌液制备”项进行。

　　2.2供试液制备称取样品5份，每份10g，分别加TSB制成稀释倍数为1:10、1:20、1:50、1:80、1:100的供试液。

　　2.3计数方法适用性试验[4]

　　2.3.1预试验试验组(a)需氧菌计数：分别取1:20、1:50、1:100供试液，各稀释倍数分别加入“2.1”项下制备好的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀，使每mL的供试液中含菌量不大于100cfu。

　　分别取2mL上述混合液，注于两个平皿(d=90mm)中(每皿1mL)，倒入15mLTSA，34℃培养3d计数。霉菌和酵母菌总数计数：分别取1:10、1:50、1:80供试液，各稀释倍数分别加入“2.1”项下制备好的白色念珠菌、黑曲霉，混匀，使每mL的供试液中含菌量不大于100cfu。

　　分别取2mL上述混合液，注于两个平皿(d=90mm)中(每皿1mL)，倒入15mLSDA，23℃培养5d计数。试验组(b)需氧菌计数：分别取1:20、1:50、1:80供试液，注于直径为150mm的平皿中，倒入约70mLTSA，其它操作同“试验组(a)”。霉菌和酵母菌总数计数：分别取1:10、1:50、1:80供试液，注于直径为150mm的平皿中，倒入约70mLTSA，其它操作同“试验组(a)”。

　　供试液对照组：以TSB代替菌液，其它操作同“试验组(a)”与“试验组(b)”。菌液对照组：以TSB代替供试液，其它操作同“试验组(a)”与“试验组(b)”。

　　2.3.2预试验结果

　　采用直径为90mm平皿，按试验组(a)方法，选取批号为20170706的样品进行预试验，该品种样品对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌的生长均有抑制作用。

　　在需氧菌计数部分，当供试液稀释倍数为1:50时金黄色葡萄球菌的回收比值升至0.69，说明抑菌作用得到一定消除;当稀释倍数到1:100时，白色念珠菌回收比值为0.51，稍大于2015版中国药典规定的下限0.5。在霉菌和酵母菌总数计数预试验中，白色念珠菌的生长受到强烈抑制，当供试液稀释倍数为1:80回收比值为0.45，不能达到药典规定要求;由于限度规定要求，无法再扩大霉菌和酵母菌总数计数的供试液稀释倍数。故考虑采用更大直径平皿来进行回收比值试验。

　　采用直径为150mm的平皿，按试验组(b)方法，当稀释倍数为1:80时，其在TSA、SDA上的回收比值分别为0.87、0.77，药品的抑菌作用得到较好消除。故采用直径为150mm的平皿，选取供试液稀释倍数1:80，进行正式试验。

　　2.3.3正式试验结果

　　可知采用直径150mm平皿，当供试液稀释倍数为1:80时，各株菌回收比值均在0.5~2.0范围内，说明样品对计数方法试验菌的影响得到了有效消除。

　　2.4控制菌检查法适用性试验[4]

　　2.4.1大肠埃希菌检查

　　各取1:10供试液10mL，分别加入100mLTSB中，加入不大于100cfu大肠埃希菌，34℃培养18h。取1mL培养物至100mL麦康凯液体，43℃培养24h后，划线于麦康凯琼脂上，34℃培养18h后，观察并鉴定菌落。

　　2.4.2耐胆盐革兰阴性菌检查

　　取3个批号1:10供试液2mL，分别加至10mL肠道菌增菌液(每管1mL)，每批号样品混合物中分别加入小于100cfu大肠埃希菌与铜绿假单胞菌，34℃培养24h后，划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂上，34℃培养18h，观察并鉴定菌落。

　　2.4.3沙门氏菌检查

　　取10g供试品加100mL，34℃培养18h后，取0.1mL接种至10mLRV沙门菌增菌液体中，34℃培养18h，划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂上，34℃培养18h，观察并鉴定菌落。

　　2.4.4结果

　　当TSB为100mL时，大肠埃希菌和沙门菌均能检出;当肠道菌增菌液为10mL时，耐胆盐革兰阴性菌检查对应阳性菌可检出。

　　3讨论

　　本研究样品组分中的土大黄[5-6]、黄芩[7-8]、穿心莲[9]对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有较强的抑制作用。本研究尝试通过扩大供试液稀释倍数来提升回收比值，但当采用一般常用的直径90mm平皿、稀释倍数为1:80时，霉菌和酵母菌总数计数回收比值仍达不到0.5，若再增大供试液稀释倍数则不利于结果的判定(药典规定限值为102cfu·mL-1);另外该品种药品含有较多药渣，不宜采用薄膜过滤法。故考虑采用直径150mm平皿，通过扩大TSA、SDA培养基的体积消除进一步抑菌作用以建立适宜检查方法。

　　关于采用大于常规直径平皿进行检查方法建立，在《中国药典分析检测技术指南》[10]中，有“可使用大平皿增加取样量以减少取样误差”的描述。在已发表文献中，李辉等[11]通过大平皿来解决低限值外用药的取样问题。但目前未查阅到采用大平皿来进一步消除样品抑菌性的报道。

　　本研究结果表明，对同样稀释倍数供试液，采用大平皿计数的白色念珠菌回收比值高于常规平皿法的;就其在TSA上生长而言，采用大平皿稀释倍数为1:80时回收比值甚至高于采用常规平皿稀释倍数为1:100的结果。说明结合扩大供试液稀释倍数、采用直径较大平皿进行试验，是消除不利于薄膜过滤样品抑菌作用的适宜方法。

　　参考文献

　　[1]国家食品药品监督管理局.国家药品标准颁布件-胆炎康胶囊：WS-10805(ZD-0805)-2002-2012Z[S](2002年11月16日)[2018年12月11日].

　　[2]成培光，李晓云，刘青梅.高效液相色谱法测定胆炎康胶囊中黄芩苷的含量[J].解放军药学学报，2010,26(5):442-443.

　　[3]胡昌勤.药品微生物控制现状与展望[J].中国药学杂志，2015,50(20)：1747-1751.

　　[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)[S].4部.北京：中国医药科技出版社，2015:140-150.

　　医药方向评职称论文知识：第八版医药卫生类中文核心期刊表_中文核心期刊要目总览

　　1、中华医学杂志;2、南方医科大学学报;3、北京大学学报.医学版;4、中国医学科学院学报;5、第三军医大学学报;6、解放军医学杂志;7、中南大学学报.医学版;8、华中科技大学学报.医学版;9、浙江大学学报.医学版;10、复旦学报.医学版。

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