针叶树种再生及遗传转化研究进展

　　摘要针叶树种是中国主要用材和绿化树种，由于针叶树种基因组复杂且庞大、生长周期长、生根率低、移栽成活率低等诸多因素导致其再生及遗传改良困难。本文针对目前针叶树种无性繁殖能力弱，遗传改良困难等问题，查阅国内外文献，总结了针叶树种再生和遗传转化的研究进展，对影响针叶树再生和遗传转化的因素进行讨论，以期为针叶树的苗木培育、遗传改良和基因工程育种提供参考。

　　关键词针叶树种;再生;遗传转化;研究进展

　　我国针叶树从南到北分布极广，占森林资源总面积的50%以上郑武林,2014)，是裸子植物的2/3(WangandRan,2014)。针叶树是天然林和人工林建设的重要树种，具有重要的生态和经济价值。建立针叶树种高效、稳定的再生体系是针叶树快速扩繁培育苗木及成功进行遗产转化的前提。本研究对针叶树再生及遗传转化研究现状进行了综述，以期为针叶树再生和转化提供高效的技术和新的研究方向。

　　现有的针叶树种再生及遗传转化研究中存在不定芽诱导率低、生根难、移栽成活率低、体胚发生时间长、畸形率高、发生不同步与转化体系难建立、对抗生素敏感、难以分化、转化率低等诸多问题。尽管针叶树种的再生和遗传转化体系并不完善，但也有学者尝试在松科Pinaceae)、柏科Cupressaceae)、杉科Taxodiacea)等几十种针叶树种通过体细胞胚胎发生途径和农杆菌介导的遗传转化成功获得了转化体系朱彩虹,2011)，为具有特殊优良性状的基因转入针叶树种提供技术支持和可能，为针叶树种的快速繁育、良种选育和抗逆性研究提供了技术支撑和实践依据。针叶树种离体再生建立植物再生体系主要有两种途径，分别是器官发生和体细胞胚胎发生。

　　其中器官发生包括直接和间接发生郑武林,2014，直接器官发生是指直接诱导产生不定芽、不定根的过程;间接器官发生是指外植体先形成愈伤组织，经过愈伤组织再分化成不定芽、不定根的过程。而体细胞胚胎发生也分为直接途径和间接途径，其中外植体经过胚性细胞分化之后直接形成胚状体的过程是直接途径;先产生愈伤组织，之后在愈伤组织表面分化形成体细胞胚的过程是间接途径李坤坤和徐昌杰,2017。影响针叶树种再生的主要因素有培养条件、外植体的选择与消毒、培养基的类型、植物生长调节剂等。

　　1.1外植体的选择

　　针叶树种的合子胚未成熟胚,成熟胚、针叶、茎段、愈伤组织胚性,非胚性等均可作为外植体。自Hakman等(1985)首次成功报道挪威云杉Piceaabies体细胞胚胎发生植株再生以来，在后续的研究中发现，用成熟合子胚或未成熟合子胚进行针叶树种繁殖是目前最具潜力的手段张宇,2006)。已报道的针叶树种使用体细胞胚作为外植体的研究较多，刘宝光等(2010)以红皮云杉Piceakoraiensis的未成熟胚为材料进行不定芽诱导，愈伤组织诱导率可达96.7%。张文泉和闫伟(2013)以樟子松Pinussylvestris成熟胚为外植体，愈伤组织诱导率为91.6%。张建伟等(2014)使用云杉Piceaasperata的未成熟胚为外植体，愈伤组织诱导率100%。

　　高芳等(2017)选择红松Pinuskoraiensis完整种仁及不同部位为外植体，进行诱导胚性愈伤组织建立了再生体系，其中未成熟种仁实现体胚发生与植株再生，植株成活率为46.6%。除了体胚作为外植体以外，也有部分研究通过培养下胚轴、茎段、鳞叶得到了再生植株。谢忠利等(2019)以北美红杉Sequoiasempervirens带芽茎段为受体材料，个外植体通过繁芽平均可产生21.5个丛生芽，诱导芽率高达2153.3%。王晨等(2020)采用柳杉Cryptomeriafortunei的茎段为外植体诱导不定芽，有效解决柳杉丛芽分化能力强而芽伸长不足的问题。周成城等(2020)以福建柏Fokienhodginsii的鳞叶和茎段受体材料诱导愈伤组织，试验显示，茎段出愈率比鳞叶出愈率低。

　　1.2外植体消毒

　　消毒是再生体系建立的首要步骤，外植体有效消毒是实现后期正常生长及分化的先决条件。根据外植体选取的不同时间及不同部位，消毒剂的选择，消毒时间的控制有较大的差异。在目前针叶树种外植体常用的消毒剂70%～75%乙醇(COH)、升汞(HgCl、次氯酸钠(NaClO)中，HgCl的消毒效果最佳，NaClO次之。尽管HgCl的消毒效果显著，考虑到它对人体产生极大的毒性，近年来被严格管控使用，而NaClO毒性低于HgCl，被广泛使用高春智等,2013;费昭雪等,2020)。

　　谢忠利等(2019)在对北美红杉茎段进行消毒时，对比之后发现选用75%COH和0.1%HgCl具有较好的消毒效果。此外，殳晓强(2017)先采用70%OH对马尾松Pinusmassoniana种子消毒1min，再用0.1%HgCl处理10min，消毒效果较好，成活率达90%。在杉木Cunninghamialanceolata针叶消毒中，0.1%HgCl添加30mg/LVc获得最佳消毒效果魏文桃等,2021)。

　　1.3初代培养

　　选择合适的培养基和植物生长调节剂对针叶树种初代培养至关重要，目前最常用的基本培养基有MS、DCR、LM、1/2LM、SH、LP以及改良MS培养基等李清清等,2012)。研究显示LM、1/2LM培养基适用于云杉属植物胚性愈伤及体胚的诱导(Chenetal.,2010;代金玲等,2016)。植物生长调节剂使用的细胞分裂素一般选择苄氨基嘌呤(6BA)、二氯苯氧乙酸(2,4D)、噻苯隆(TDZ)3种，细胞生长素选择的类型有α萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)等。目前研究者已对BA与NAA两种植物激素的最适浓度和比例进行了深入研究。祝晨辰等(2015)以柳杉不同无性系当年生茎段为外植体，结果表明在DCR培养基上添加0.1mg/L6BA和0.05mg/LNAA诱导率最高，达81.7%。

　　王可佳等(2021)尝试以落叶松Larixolgensis针叶为材料进行再生试验，以DCR+2mg/LBA+0.2mg/LNAA为不定芽诱导的较佳配方，不定芽诱导率为66.33%，平均芽数80个外植体，说明以针叶为外植体，也能获得较高的再生率。郑武林(2014)以马尾松下胚轴为外植体，马尾松下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基为DCR+2.0mg/L6BA+0.2mg/LNAA，愈伤组织诱导频率为98.8%。在部分针叶树种再生体系中显示，仅添加BA也可以诱导不定芽发生，且不定芽系数达69%(于大德等,2011)，这与唐婷婷015)在马尾松顶芽诱导不定芽时单独使用的BA实验结果相吻合。

　　此外，适当比例的BA和2,4较易诱导胚性愈伤组织，且和激动素KT组合使用能明显提高诱导率孙敬爽和贾桂霞,2010;白玉娥等,2015)。总体而言，在初代培养中较低浓度的植物生长调节剂对外植体的启动有较好的响应，细胞分裂素和植物生长素的组合使用比它们分别使用对外植体的诱导效果理想，通常NAA浓度低于BA浓度，在直接诱导不定芽时，BA选择0.5～2.0mg/L、NAA选择0.05～0.2mg/L较适宜。在体胚发生途径2,4选择0.5～1.0mg/L、BA选择0.1～2.0mg/L较适宜。

　　1.4增殖培养

　　在针叶树种的继代增殖培养阶段，影响丛生芽继代增殖的关键因素是不同生长调节剂的配比，增殖培养使用的生长调节剂主要有AA、BA和2,4等，偶尔也使用KT。在GD培养基中，当BA浓度为0.5～2mg/L和NAA浓度为0.5mg/L、2,4浓度为0.5～2mg/L组合使用时，马尾松嫩茎愈伤组织的增殖能力最强，增殖系数最大杨模华等,2009)。在MS培养基中，柽柳Tamarixchinensis芽增殖时BA和NAA比值0.1～1.5mg/L时导致产生变态芽，比值调为0.2～0.5mg/L时，出芽率明显变少，MS+6BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L为最佳的继代增殖组合，增殖率达到100%(魏海霞等,2020)。

　　许建秀等(2017)在对赤松Pinusdensiflora胚性愈伤组织进行试验中发现，联合使用1.0mg/L2,4、1.0mg/L6BA和4.0mg/LNAA，增殖率达215.10%，愈伤组织呈白色透明，有典型丝状结构，但出现水渍化，而在2.0mg/L6BA和4.0mg/LNAA的组合中，增殖率达211.93%，愈伤组织呈白色透明，有典型丝状结构，无水渍化现象出现，确定为最佳激素组合。对于针叶树器官性愈伤组织来说，继代过程中褐化现象比较严重，这可能与细胞在增殖过程中衰老死亡有关。在湿地松愈伤组织增殖过程中添加抗氧化剂PVP或Vc均未能有效的抑制褐化，为此在今后的研究中，应探索适宜的抗氧化剂以降低组织褐化现象吴丽君,2008)。

　　1.5生根培养

　　对于针叶树种来说，虽在初代培养和增殖培养阶段能获得无菌苗，但是多数无菌苗仍存在生根率低、不定根数少和移栽成活率低等问题。目前针叶树生根多以WPM、DCR或1/2BM作为基本培养基张莉,016;谢忠利等,019;王晨等,2020;周小雪等,020)，其最终生根率约为20%～90%。

　　这些结果说明，在生根培养阶段，培养基的无机盐质量浓度降低能有效提高根系的生长。现阶段针叶树生根培养所使用的主流植物激素有IBA、NAA和IAA，研究表明蒋时姣等,014)，一定浓度的IBA和NAA或IAA配合使用，诱导生根效果较好，但也有研究显示刘宝光等,010;李哲馨等2017;王晨等,020)，培养基中仅添加IBA或IAA时也能诱导根的形成且存活率较高。除此之外，研究发现，在培养基中添加0.05%活性炭(AC)会提高墨西哥落羽杉Taxodiummucronatum不定根的诱导率许秀玉等2007)，这种结果可能是由于活性炭在吸附培养基有害物质的过程中为根的形成提供了黑暗的生长环境有关。

　　2针叶树种遗传转化

　　由于针叶树种再生体系的建立存在一定难度，因此其遗传转化体系起步也较晚，但近年来得到的相应科研成果也很多。早在1976年，DeCleene和DeLey首次报道根癌农杆菌菌株BB6(LMG187)也能感染裸子植物受伤组织并产生冠瘿瘤后，关于针叶树种遗传转化体系的研究有了很好的开展张利,2012)。

　　1991年，美国学者Huang等(1991)以农杆菌介导的方法将11325菌株在欧洲落叶松Larixdecidua中有效表达，首次建立了欧洲落叶松的遗传转化体系。目前针叶树种遗传转化相关研究在国内外均有报道，主要为培育抗病虫害新品种、选育优良种质、提高树种品质等几个方面BishopHurleyetal.,2001;Pavingerováetal.,2011;řízaetal.,2013;Maetal.,2020)。目前，农杆菌介导法在针叶树种遗传转化过程中广泛使用。

　　农杆菌的类型有发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes和根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens两种，均可将外源基因导入植物细胞。发根农杆菌含Ri质粒，可以诱导被侵染的植物细胞形成发状根;根癌农杆菌含Ti质粒，可以诱导被侵染的植物细胞长成肿瘤。农杆菌介导的遗传转化由于效率高、可重复性好而成为植物中最常规、最广泛的遗传转化途径王亮,2015;王栋鑫等,2018。

　　3展望

　　2000年以来，在松科类树种中，针叶树种再生及转基因研究取得了显著的成果。但总体而言，但总体而言，拥有稳定遗传转化体系的树种不多，且转化效率不高，有很多针叶树种的再生仍存在些许问题，问题如下：(1)再生体系建立方面，外植体褐化不能伸长或发生坏死，污染率高，增殖率低Sarmast,2016)形态变异，玻璃化，生根、再生率低;(2)针叶树种体细胞无性系变异难，降低生物多样性;(3)常规育种与分子育种之间结合不紧密，系统的转基因植株推广及应用成果不多，应对获得的转基因株系生长、生理指标、生化指标、抗性、木材性状等多性状进行综合评价潘艳艳等,2016)。今后的工作需要重点对以上问题进行研究并逐步攻克。

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　　(1)建立高效稳定的针叶树种再生体系并广泛应用于遗传转化，从而为针叶树种基因功能研究和分子育种研究等基础工作提供有力的技术平台;(2)借助高通量测序和生物信息学，包括蛋白互作、代谢通路等新技术，挖掘针叶树种中优良基因，为培育抗性能力强、速生、高产新品种奠定基础，以便加快对针叶树种分子生物学研究的进程;(3)将分子生物学技术与传统育种方法有效结合，Sarmast(2016)再加上利用其他前沿方法，获得转基因针叶树种，如基因编辑技术，其应用仍具有很大的发展空间。

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　　作者：1哈斯图雅代金玲吉仁花白玉娥

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