本文摘要：摘要：为明确江西省丝瓜果实腐烂病病原菌种类及病原菌寄主范围，从江西省南昌市和赣州市丝瓜种植区采集具有典型症状的腐烂病病果并进行病原菌分离，采用形态学观察、致病性测定和分子生物学技术对其种类进行鉴定，并接种7种作物幼苗以明确其寄主范围。结果表
摘要：为明确江西省丝瓜果实腐烂病病原菌种类及病原菌寄主范围，从江西省南昌市和赣州市丝瓜种植区采集具有典型症状的腐烂病病果并进行病原菌分离，采用形态学观察、致病性测定和分子生物学技术对其种类进行鉴定，并接种7种作物幼苗以明确其寄主范围。结果表明，从丝瓜烂果病病样中共分离到2株菌株，分别命名为SG-1和SG-2，2株菌株形态特征一致，菌落呈圆形，气生菌丝发达，有膨大的孢子囊，孢子囊萌发有泡囊产生，有性生殖还可见雄器和藏卵器。在以ITS、Cox2、β-tubulin3个基因构建的系统发育树中，菌株SG-1、SG-2和瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)聚在同一个分支，结合上述结果，将此次采集的丝瓜果实腐烂病病原鉴定为瓜果腐霉。将该病原菌接种葫芦科的黄瓜，茄科的辣椒、茄子，十字花科的白菜、西兰花，锦葵科的秋葵等代表性作物幼苗，结果表明其还可以引起幼苗猝倒病。
关键词：丝瓜果实腐烂病;病原鉴定;瓜果腐霉;寄主范围;Cox2基因;β-tubulin基因
丝瓜(Luffacylindrica)隶属葫芦科丝瓜属，主要种植于热带和亚热带，如中国、泰国、印度、马来西亚等[1]。丝瓜是我国常见的瓜类蔬菜之一，分为普通丝瓜和有棱丝瓜2个栽培种[2]，营养价值丰富，果肉中不仅富含蛋白质、维生素、钙磷铁等元素，还具有抗衰老和抗过敏等保健作用和药用价值[3-4];成熟的丝瓜由于其发达的网状纤维且天然易降解还可替代海绵作为一种环保的洗刷灶具[5]。丝瓜在江西省多个县(市、区)均有种植，据调查，丝瓜约占江西省瓜类蔬菜资源总量的18.3%[6]。
果树种植论文：西瓜果实形状的分子精准鉴定
作者2019年7—8月到田间调查发现，有部分丝瓜发生烂果现象，对产量和品质造成了较大影响，由于尚不清楚各地区丝瓜果实腐烂病由何种病原菌引起，因此对病原菌进行系统分离鉴定，并明确其寄主范围，对生产上防治该病害具有重要意义。关于枯萎病、炭疽病、病毒病、蔓枯病等丝瓜生产上常见病害的病原鉴定已有较多报道。彭家柱等根据形态学鉴定和ITS序列分析相结合的方法将丝瓜枯萎病病原鉴定为尖孢镰刀菌[7];孙蕾对吉林省丝瓜、黄瓜、西瓜等11种葫芦科作物炭疽病病原进行了鉴定，通过联合ITS、CHS1和GAPDH多基因测序分析，确定丝瓜、黄瓜等的病原为圆刺盘孢(Colletotrichumorbiculare)，西瓜炭疽病的病原有2种，分别为C.orbiculare和C.incanum，苦瓜炭疽病的病原为C.incanum，表明不同寄主病原不尽相同[8]。
牛二波对山西省丝瓜病毒病病原检测结果表明，丝瓜受小西葫芦黄化叶病毒(zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV)和黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，CMV)复合侵染[9]。目前对丝瓜果实病害病原鉴定的研究较少，对丝瓜果实腐烂病的研究主要见于常规发生和防治介绍，尚未发现对丝瓜果实腐烂病病原菌分子系统学方面的研究。本研究拟通过对病原菌进行形态学观察、致病性测定，结合核糖体内 转录间隔区(ITS)、细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因(Cox2)和β微管蛋白基因(β-tubulin)部分序列的多核苷酸序列系统学分析等方法，对引起江西省丝瓜果实腐烂病的病原菌进行鉴定，同时对该病原菌进行寄主范围测定，以期为生产上该病害的防治及不同作物的选育种植提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
分别于2019年7—8月从江西省南昌市和赣州市采集丝瓜果实腐烂病典型病样，带回实验室进行分离。丝瓜、黄瓜、番茄、茄子、白菜、西兰花、秋葵种子购自当地种子市场。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar，PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，蒸馏水定容至1L。V8培养基：罐装V8汁330mL、CaCO33.3g，4层纱布过滤，按体积比1∶9加入纯水进行稀释，如配固体培养基再按1.5%加入琼脂粉。TaKaRaTaq，购自宝生物工程(大连)有限公司;DL2000Marker，购自湖南擎科生物技术有限公司;PCR回收试剂盒，购自美国Axygen公司;其余试剂均为国产分析纯。
MyCyclerPCR仪，购自美国Bio-Rad公司;JC600电泳仪，购自北京君意东方电泳设备有限公司;Alpha5500型凝胶扫描仪，购自美国AlphaInnotech公司;PGX-330A-3HM型生化培养箱，购自宁波莱福科技有限公司;IX53显微镜，购自奥林巴斯(中国)有限公司。
1.2 病原菌的分离与纯化按常规组织分离法分离病原菌[10]。用无菌水冲洗具有典型丝瓜果实腐烂病症状的病果，于病健交界处切取5mm×5mm大小的组织块，用70%乙醇浸泡消毒30～60s，随后用无菌水漂洗3次，置于含50μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL利福平的PDA平板上，置于温度为25℃的生化培养箱中黑暗培养3d，待菌落长出后，挑取菌落边缘菌丝转移至新的V8平板上培养，随后单孢分离纯化菌株，并将菌株接种于V8斜面培养基上，置于13℃培养箱中保存。
1.3 致病性测定
1.3.1 原寄主致病性测定按照科赫氏法则，取健康的丝瓜作为接种材料，将丝瓜先用自来水洗净，再用75%乙醇擦拭表面并晾干。将分离获得的菌株在V8培养基上培养3d，用直径5mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，直接接种到健康丝瓜果实上，以接种无菌培养基为对照，接种样品放入托盘中保湿，置于25℃培养箱中培养2d。待果实发病后进行病原菌的再分离，方法同上。
1.3.2 对丝瓜及其他寄主致病性测定除丝瓜外，选取葫芦科的黄瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西兰花，锦葵科的秋葵为代表作物，将各作物种子催芽后播种在一次性塑料杯中，置于恒温光照培养箱中16h/8h光暗交替培养，培养约10d后在幼苗茎基部接种病原菌孢子悬浮液(将病原菌在V8培养基上25℃培养3d，切取小块菌丝块放入V8液体培养基中培养2d，用灭菌自来水洗净菌丝，诱导游动孢子，将游动孢子浓度稀释为1×105个/mL)，接种后保湿培养，观察并记录发病情况。
1.4 形态学鉴定将纯化后的菌株接种到V8培养基上，于25℃恒温培养箱中培养，3d后观察菌丝生长形态及颜色，并于显微镜下观察泡囊的形态特征;15d后在显微镜下观察有性生殖器官形态，共计测量了50个性器官和泡囊。按照vanderPlaats-Niterink等的方法[11-12]对病原菌进行形态学鉴定。
1.5 分子生物学鉴定
选取在V8平板上培养3d左右的菌株，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼置于V8液体培养基中培养2～3d，收集病原菌菌丝并用液氮冷冻研磨，采用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)法提取病原菌DNA。
分别使用rDNA-ITS区通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，Cox2基因特异性引物FM66(5′-TAGGATTTCAAGATCCTGC-3′)/FM58(5′-CCACAAATTTCACTACATTGA-3′)及β-tubulin基因特异性引物BT5(5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′)/BT6(5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′)[13]进行PCR扩增。反应总体积50μL：10×PCRbuffer5μL、2.5mmol/LdNTPMix4μL、上下游引物各1μL、100ng/μLDNA模板1μL、Taq酶0.3μL，ddH2O补足至50μL。反应程序：94℃3min;94℃20s，55℃30s，72℃1min，35个循环;72℃5min。
取5μLPCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增产物送至湖南擎科生物技术有限公司进行测序。将所得的ITS、Cox2和β-tubulin基因序列用NCBI中BlastN程序进行同源性比对分析，将序列提交到NCBI/GenBank获得基因登录号。下载参比菌株各基因同源性较高的已知序列及邻近属种序列，将各基因串联成数据集，使用ClutalX工具进行多重序列比对，将序列编辑、调整后，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)应用MEGA7.0软件构建系统发育树，Bootstrap值重复1000次。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离及致病性测定
从南昌市和赣州市各分离获得1株菌株，命名为SG-1、SG-2。
2.1.1 对丝瓜果实的致病性测定
将获得的病原菌回接至健康的丝瓜果实中，恒温培养约24h后观察发现，丝瓜果实上出现的症状与田间发病症状基本相似，在接种部位出现水渍状褐色斑点，接种表面还有褐色霉层，而对照果实未出现发病症状。随机挑取发病组织进行再分离，获得与原菌株一致的病原菌，根据科赫氏法则，确定该菌为引起丝瓜果实腐烂病的病原菌。
2.1.2 对丝瓜及其他作物幼苗的致病性测定
选取生长10d左右的丝瓜、黄瓜、番茄、茄子、白菜、西兰花、秋葵幼苗作为接种材料，用移液枪吸取游动孢子悬浮液注入幼苗根部，1～2d后发现植株开始猝倒，接种部位部分萎缩，同时有水渍状病斑出现。
2.2 病原菌形态学鉴定
病原菌在V8平板上培养时，菌落生长迅速、呈圆形、菌丝白色、气生菌丝发达。在显微镜下观察，孢子囊呈姜瓣状或膨大菌丝状，孢子囊萌发时顶端可产生泡囊，内生游动孢子。藏卵器球形，直径19.2～29.1μm，柄较直，雄器侧生，宽棍棒状或近柠檬形，大小为(9.8～16.2)μm×(8.3～13.6)μm，卵孢子球形，直径(16.4～21.9)μm，平滑，不满器。上述结果与文献中报道的腐霉属中瓜果腐霉的形态特征和测量结果基本一致，初步将丝瓜果实腐烂病病原菌鉴定为瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)。
2.3 病原菌分子生物学鉴定
以ITS、Cox2和β-tubulin基因通用引物分别扩增SG-1、SG-2菌株gDNA，扩增SG-1分别得到长度为867、592、683bp的片段(登录号分别为MT598010、MT857739、MT857741);扩增SG-2分别得到长度为865、590、682bp的片段(登录号分别为MT598009、MT857740、MT857742)，将3个基因序列串联后构建系统发育树，结果显示，SG-1、SG-2与瓜果腐霉均聚在同一分支，进化上的距离最近。结合上述病原菌的形态特征及分子生物学鉴定结果，确定本次在江西省丝瓜上分离的果实腐烂病病原菌为瓜果腐霉。
3 结论与讨论
腐霉菌是一类重要的作物土传病害病原菌[14]，腐霉菌的卵孢子可在土壤中长期存活，且该病害传播蔓延迅速，一旦发生将难以控制。之前有报道造成丝瓜果实腐烂的病原有腐霉和疫霉等[15]，由于二者引起的病害发病时间及发病症状均较为相似，生产上容易造成误判，因此明确致病病原菌至关重要。过去主要根据形态学特征对腐霉菌进行分类，由于多数腐霉菌的形态特征不稳定，有些分类特征存在交叉性，且大多数为异宗配合，这些均限制了腐霉病害诊断的准确性[16]，赵思峰等分离的120个腐霉菌中有29个分离物因未诱发出雄器和藏卵器而无法鉴定到种[17]。目前主要采用形态学和分子生物学相结合的方法对病原菌进行鉴定。
腐霉属内包含多个近缘种，核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列作为特异性的靶标被广泛应用于多种病原菌的分子检测，但是ITS序列并不能完全区分所有亲缘关系近的种[18]，结合形态学特征及多基因序列分析才能对病原菌进行准确鉴定。Martin等利用Cox2基因序列对24种腐霉的遗传进化关系进行了分析，指出腐霉的系统发育与腐霉的孢子囊或菌丝体存在相关性[19];Belbahri等在对腐霉ITS序列分析的基础上也分析了EF-1α、β-tubulin和nadh1的基因序列，揭示了这些基因在菌株内和不同菌株之间具有高水平的杂合性和多态性[20]。
本研究通过对分离自江西省南昌市和赣州市丝瓜果实腐烂病的病原菌菌落、泡囊、雄器和藏卵器等形态特征观察、致病性测定，联合ITS、Cox2和β-tubulin多基因序列对丝瓜果实腐烂病病原菌进行分子生物学鉴定和系统进化关系分析，明确江西省丝瓜果实腐烂病的病原菌为瓜果腐霉，这是目前国内首次对丝瓜果实腐烂病病原进行的系统分离鉴定。瓜果腐霉为我国第一个报道的腐霉种，也是腐霉属中致病力最强的种之一，可以侵染多种寄主植物[21]。
徐作廷等从玉米根部分离的瓜果腐霉能引起玉米苗期茎腐病[22]，deCara等从哈密瓜苗期分离的瓜果腐霉能引起哈密瓜苗期植株死亡[23]，银铃等从菠菜猝倒病苗期分离的瓜果腐霉能引起菠菜幼苗猝倒病和根腐病[24]，Al-Sheikh从小麦种植区根际分离的瓜果腐霉能引起小麦幼苗猝倒病和根腐病[25]。本研究从丝瓜果实中分离出的瓜果腐霉除了能引起丝瓜果实腐烂和幼苗猝倒外，接种葫芦科的黄瓜，茄科的番茄、茄子，十字花科的白菜、西兰花，锦葵科的秋葵等幼苗发现均能引起植株猝倒。因此生产上防治该病害时，轮作意义不大，而应加强农田水分管理，注意排水、高垄等，同时选择抗性品种及生物防治等手段进行综合控制。
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[8]孙蕾.吉林省葫芦科作物炭疽病的病原鉴定及药剂筛选[D].长春：吉林农业大学，2019.
作者：邹芬1，何烈干1，赖金美2，李湘民1，黄瑞荣1，马辉刚1
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