本文摘要：摘要目的:建立地龙蚓激酶生物效价测定方法，通过测定地龙的蚓激酶生物活性，比较不同基原、不同炮制方法地龙的差异性，进而对地龙产地加工与应用提出一定的理论依据和建议。方法:用标准曲线法计算蚓激酶生物效价，从方法耐用性、专属性、线性范围、精密度、
摘要目的:建立地龙蚓激酶生物效价测定方法，通过测定地龙的蚓激酶生物活性，比较不同基原、不同炮制方法地龙的差异性，进而对地龙产地加工与应用提出一定的理论依据和建议。方法:用标准曲线法计算蚓激酶生物效价，从方法耐用性、专属性、线性范围、精密度、回收率等方面对的地龙中蚓激酶生物效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行了方法学考察.并分别测定不同来源不同炮制方法的地龙的蚓激酶生物活性。
结果:不同琼脂糖、不同纤维蛋白原对本法测定影响较小，阴性对照无干扰;本法线性范围为12.5～400U，回收率为86.16%，精密度试验RSD为0.98%;地龙药材的蚓激酶生物活性在低于60度时基本稳定。考察不同来源、不同炮制方法地龙22批，表明地龙蚓激酶生物效价差异很大。结论:琼脂糖纤维蛋白平板法可以快速、简便、准确地测定蚓激酶的生物活性，用标准曲线法可以控制测定的误差，本法可评价不同来源和不同炮制方法地龙的蚓激酶生物活性，指导和规范研发、产地加工、生产和临床单位对地龙正确合理的使用。
关键词:地龙,纤维蛋白原,蚓激酶,生物效价,基原
地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥体，前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”[1]。用于治疗血栓[2]，顽固性发热，惊厥，哮喘等。主要有效成分有纤溶酶，蚓激酶，胶原酶，次黄嘌呤[3]，琥珀酸，花生四烯酸，γ-氨基丁酸等。地龙在使用过程中具有伪品较多，基源混乱[4]的问题，《中华人民共和国药典》(以下简称版《中国药典》)2015年版项目包括性状鉴别，显微鉴别，两个薄层鉴别，杂质，水分，总灰分，酸不溶性灰分，重金属，黄曲霉，浸出物。
该版《中国药典》收载的鉴别项目为检测氨基酸和对照药材，其方法的专属性不强;此外，对地龙的生物活性成分没有质控项，现行质量标准不能直接反应临床疗效，不能有效地控制地龙的质量。已有报道地龙生物活性测定方法非常少，本实验室曾报道溶栓胶囊中蚓激酶效价测定方法[5]，采用纤维蛋白平板法，统计方法为量反应平行线法。本文旨在研究一种与地龙临床活血化淤功效相关的生物活性检测方法，以建立成熟可行的生物活性测定质量控制方法，并用此方法评价不同来源和不同炮制方法对其地龙质量的影响，同时指导和规范研发、生产、临床单位对地龙正确合理的使用。
1试验材料
1.1仪器
万能高速粉碎机(浙江红景天工贸有限公司);LC-365A超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂);电热鼓风干燥箱(MemmertUF110);游标卡尺(哈尔滨量具刀具厂)。直径10cm的培养皿若干。
1.2标准品及试剂
蚓激酶对照品(批号140650-201703、140650-201804)、纤维蛋白原(牛血)(批号140607-201740、140607-201137、140607-200736)、牛凝血酶(批号140605-201526、140605-200424、140605-201124)均为中国食品药品检定研究院提供。纤维蛋白原(批号411H021)及琼脂糖购自Solarbio。
1.3样品
地龙药材20110901，20110902，20111001均由山西省食品药品检验所提供，用DNA测序鉴定法鉴定。
2方法与结果
2.1标准品溶液的制备
取蚓激酶标准品，用0.9%氯化钠溶液制成5.0、10.0、20.0U·μL-1的溶液。
2.2供试品溶液的制备
取地龙药材粉碎至无块状，精密称定5g，至100mL量瓶中，加0.9%氯化钠溶液约30mL，超声30min，定容。摇匀，取适量4000r·min离心3min后，过滤，即得。每批样品制备2个平行样。
2.3琼脂糖-纤维蛋白平板制备
取琼脂糖1.5g，加工作溶液[pH7.8磷酸盐缓冲液与0.9%氯化钠溶液(1∶17)混合]100mL加热溶解。取1.5mg·mL-1纤维蛋白原溶液20mL，置烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液20mL、15BP·mL-1凝血酶溶液0.6mL，立即混匀，快速倒入2个直径10cm平皿中，室温水平放置30分钟，铺板厚度约为3.5mm，每个平皿上等距离均匀的打四个直径为2mm的点样孔，备用。
2.4培养测定
精密量取不同浓度的蚓激酶标准品溶液及供试品溶液各10μL，分别点在同一平皿中，加盖，每份样品做两个平皿，置37℃恒温箱中反应18h。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，计算溶圈面积(垂直两半径的乘积乘以3.14)。
2.5数据处理
标准曲线法是以标准品点样单位量(U)为横坐标，溶圈面积为纵坐标求回归方程，用标准曲线法计算供试品的效价。
3方法学考察
3.1专属性试验
按供试品溶液制备方法制备不加样品的阴性对照溶液，即空白溶液，采用上述方法测定效价。阴性对照样品未出现溶液溶圈。证明在本法条件下，阴性对照无干扰。
3.2耐用性试验
3.2.1不同凝血酶不同凝血酶对实验结果的影响
分别用两个批号凝血酶(牛血)铺板，按照效价方法测定2批地龙的效价。不同凝血酶对实验结果的影响，说明不同批号的凝血酶对本法测定无明显影响。
3.2.2不同纤维蛋白原对实验结果的影响
分别用两个批号纤维蛋白原铺板，按照效价方法测定2批地龙的效价。说明不同批号的纤维蛋白原对本法测定无明显影响。
3.3线性范围
取蚓激酶标准品加0.9%氯化钠注射液制成每1μL含蚓激酶为10、2.5、0.625U的标准品溶液。分别精密吸取上述10U·μL-1标准品溶液40、20、10μL和上述2.5U·μL-1、0.625U·μL-1标准品溶液20μL、20μL点样，测定溶圈面积。以点样量(U)为横坐标，溶圈面积为纵坐标求得回归方程:Y=0.9824X+97.651R2=0.9531点样量在12.5～400U范围内。
3.4准确度试验
采用加样回收法测定。取已知含量样品(批号20111001，效价898U·mg-1)，称取6份，(每份约0.5g)，分别精密称定，再精密量取蚓激酶标准品200502，效价100U·μL-1)800μL分别加入样品中，按供试品溶液制备方法制备，并按本文中效价测定方法检测，回收率计算方法为(测量效价-样品效价)/标准品加入量×100%。本法回收率为86.16%，RSD为9.65%。
3.5精密度试验
取供试品溶液(批号为20111001)，连续点样5板，测定效价。测定精密度试验RSD为0.98%。
3.6热稳定性考察
取4批地龙样品，提取液采用不同温度30、40、50、60、70、80、90℃温度水浴20min后，按溶栓圈直径乘积进行纤溶圈大小比较。提取温度为30～60℃，效价基本稳定，70℃时效价降低，80℃以上则样品基本丧失活性。说明温度对样品效价有明显影响，所以在生产，储存，提取时采用不加热超声，并且提取过程应避免温度过高。
4对不同来源不同炮制的地龙生物效价的考察
取收集的不同来源的地龙样品，按制定的蚓激酶生物效价测定法进行效价测定。可见不同来源、不同炮制方法、储存时间对中药地龙的蚓激酶生物效价差异很大。
5讨论
5.1纤溶生物活性测定法
地龙含有酶类、蛋白质、多脂类、氨基酸、微量元素和其他成分等，具有通络，活血化瘀功效，用于关节痹痛、肢体麻木、半身不遂等。现代研究表明:地龙体内溶栓成分主要有多种溶纤酶和十几种激酶。研究证明蚓激酶在体外具有很强的纤溶活性，故本品采用体外纤维蛋白平板法测定其纤溶生物活性。
5.2标准曲线法测定效价
现报道地龙纤溶生物活性测定法多采用蚓激酶效价测定法，有量反应平行法，还有采用单点法测量溶圈直径或面积来计算。前者一般原则为标准品和样品为同质，考虑地龙可能除了含有蚓激酶具有溶纤的成分外，还含有多种溶纤酶和激酶、蛋白质等其他成分，故没有采用量反应平行法。后者单点法测定其效价，结果受试剂如纤维蛋白和凝血酶、点样误差、平板制备等多种因素影响，重现性较差。故本实验采用标准曲线法测定其纤溶生物效价，可以有效地控制实验误差。
5.3对炮制工艺考察
炮制工艺采用冷冻干燥、40度干燥、室温阴干等三种方法进行考察、结果冷冻干燥工艺地龙体外纤溶生物效价最高，其次低温干燥(40℃)、室温阴干，其余晒干的样品效价均远低于前者，因此如果地龙用于活血通络时，炮制方式首选冻干处理，其次为室温阴干和低温干燥，如果需低温干燥时，生产关键参数温度需控制在40℃以下为宜。
5.4热稳定性考察
随着温度的升高，地龙纤溶生物活性呈下降趋势，但在60℃以下较稳定，提示在炮制、中药提取和储运过程中应严格控制注意温度。
6小结
本实验建立的地龙蚓激酶生物效价检测方法操作简单，专属性强，耐用性良好，能有效评价不同产地，不同炮制方法地龙的纤溶生物活性。样品检测结果显示，不同产地，不同炮制方法的地龙纤溶生物效价差异很大，虽有些产地来源的地龙无法获取具体的炮制工艺参数，但从生产批号可以推测随着储存时间的延长，生物活性呈下降趋势，2016年生产的地龙生物效价低于检出限。本品为动物源药材，主要含有多种酶、蛋白和氨基酸等成分，应对中药材前处理、提取、贮运过程中的温度进行控制。
本实验采用体外纤溶生物活性评价不同来源不同炮制的地龙质量，前期本实验室对其体内体外药效相关性进行了研究，结果显示具有良好的相关性，因此体外纤溶生物活性测定法是用于评价地龙提取纤溶成分工艺稳定性和可行性的一种有效的手段。但此方法仅限于对于地龙临床用于通络活血类的病症的评价。鉴于地龙除了具有通络活血化瘀的作用外，还具有清热定惊，平喘，利尿等功效。目前阶段对于此方面功效成分和生物活性相关性有待于进一步研究。
参考文献
[1]中国药典2015年版.一部[S].2015:122ChP2015.VolI[S].2015:122
[2]程牛亮，牛勃，张祖殉，等.地龙提取物对实验性血栓的溶解作用及有效成分的研究[J].山西医学院学报，1989，20(4):203
中药方向论文投稿刊物：《中药材》(月刊)创刊于1978年，由国家药品监督管理局主管，国家药品监督管理局中药材信息中心站主办。主要报道中药材的种(养)技术(GAP)，资源开发和利用，药材的加工炮制与养护，鉴别，成分，药理，临床，制剂，用药等方面的研究论文。
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